Izolowanie populacji komórek z tkanki mózgowej za pomocą sortowania jąder aktywowanych fluorescencją

Przenieś kawałek świeżo zamrożonej ludzkiej tkanki mózgowej do odpowiedniego młynka zawierającego bufor do lizy zimna.

Poruszaj tłuczkiem w górę i w dół, aby mechanicznie rozbić tkankę, uwalniając komórki.

Cząsteczki detergentu w buforze do lizy rozrywają błonę komórkową, uwalniając jądra.

Przenieść zawartość do odpowiedniej probówki wirówkowej i dodać zimny bufor sacharozy na dno probówki, tworząc gradient gęstości.

Wirować z dużą prędkością, aby oddzielić jądra na dnie probówki.

Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić jądra w buforowanym roztworze soli fizjologicznej.

Dodaj do jąder swoiste dla celu przeciwciała sprzężone z fluoroforem i inkubuj, aby umożliwić przeciwciału związanie się z docelowym białkiem jądrowym.

Dodaj barwnik barwiący jądrowy, aby uwidocznić nienaruszone DNA.

Wykonaj sortowanie jąder aktywowanych fluorescencją, aby posortować jądra różnych populacji komórek na podstawie różnych sygnałów fluorescencyjnych.

Rozpocznij sekcję około 200 do 400 miligramów tkanki ze świeżej, zamrożonej próbki tkanki kory mózgowej dorosłego człowieka. Umieść tkankę w 7-mililitrowym szklanym leżaczku do tkanek zawierającym 4 mililitry lodowatego buforu do lizy na lodzie i zmiel tkankę około 50 razy.

Przenieść homogenat do 12-mililitrowej probówki polipropylenowej do ultrawirówki. Użyj pipety o pojemności 5 mililitrów, aby dodać 6,5 mililitra lodowatego buforu sacharozy na dno probówki ultrawirówki, nie naruszając interfejsu między sacharozą a homogenatem tkankowym.

Aby zebrać jądra, należy ultraodwirować lizat przez jedną godzinę w temperaturze 101 814 razy g i ostrożnie zassać supernatant i zanieczyszczenia bez naruszania osadu. Dodać PBS do probówki ultrawirówkowej, ponownie zawieszając osad jądrowy.

W celu sortowania izolowanych jąder aktywowanych fluorescencyjnie, dodać około 20 mikrolitrów ponownie zawieszonej próbki do roztworu przeciwciała zawierającego mysie przeciwciało anty-NeuN sprzężone z AlexaFlour555. Dodać około 20 mikrolitrów zawieszonej próbki do roztworu przeciwciała zawierającego mysie przeciwciało anty-PAX6 sprzężone z APC. Po godzinnej inkubacji, w temperaturze 4 stopni Celsjusza z wytrząsaniem chronionym przed światłem, dodać DAPI w stosunku 1 do 1000 do wszystkich próbek i kontroli.