Uzyskiwanie różnych populacji komórek nerwowych z hipokampa szczura

Weź perfundowane fragmenty hipokampa szczura.

Inkubuj z papainą, aby strawić macierz zewnątrzkomórkową tkanki i rozluźnić komórki, w tym neurony, astrocyty i mikroglej.

Dodaj DNazę i wymieszaj.

Mechanicznie zdysocjować tkankę za pomocą pipet o stopniowo zmniejszających się średnicach, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Inkubuj dla DNazy w celu degradacji zanieczyszczającego DNA.

Przepuść zawiesinę przez sitko, usuwając zanieczyszczenia.

Dodać bufor zawierający jony dwuwartościowe, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną.

Odwirować i usunąć supernatant bogaty w enzymy.

Teraz dodaj bufor i kulki magnetyczne anty-mielinowe. Inkubuj, aby kulki związały resztki mieliny.

Po inkubacji odwirować i usunąć supernatant.

Zawiesić mieszaninę w buforze i załadować ją do kolumny separacji magnetycznej zawierającej kulki ferromagnetyczne umieszczone w polu magnetycznym sortera magnetycznego.

Pole magnetyczne zatrzymuje w kolumnie szczątki mieliny związane z kulkami magnetycznymi, podczas gdy komórki wolne od mieliny przechodzą przez nią.

Przemyć kolumnę buforem i zebrać przepływ zawierający neurony, astrocyty i mikroglej.

Rozpocznij dysocjację neuronalną za pomocą sterylnych żyletek, aby pokroić każdą próbkę pobraną z tkanek mózgowych dorosłych na małe kawałki o wielkości od 30 do 400 miligramów na pokrywie sześciodołkowej płytki hodowlanej. Następnie zanurz tkankę w 1 mililitrze HBSS bez wapnia i magnezu i za pomocą pipety przenieś próbki do sterylnych 2-mililitrowych probówek wirówkowych.

Po zebraniu wszystkich tkanek należy odwirować próbki i odessać supernatanty, a następnie inkubować próbki przez 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, odwracając probówkę kilka razy co pięć minut, aby ponownie zawiesić osadzone kawałki tkanki.

Pod koniec inkubacji dodać 30 mikrolitrów świeżo przygotowanej probówki z mieszanką enzymów do każdej próbki i delikatnie odwrócić probówki. Następnie, używając pipety Pasteura oznaczonej numerem 1, oddziel każdą próbkę za pomocą 30 tryturacji w górę iw dół, uważając, aby uniknąć generowania pęcherzyków. Inkubować próbki przez kolejne 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z inwersją co pięć minut, a następnie dysocjację próbek za pomocą pipety Pasteura nr 2, jak właśnie pokazano.

Następnie przełącz się na pipetę nr 3. Powtórzyć dysocjację i inkubować próbki jeszcze przez 10 minut w łaźni wodnej, z inwersją co pięć minut. Pod koniec inkubacji przefiltruj zawiesiny jednokomórkowe przez sitka do komórek o średnicy 80 mikronów do 15-mililitrowych probówek Falcon, myjąc każde sitko 10 mililitrami HBSS bez wapnia i magnezu, aby zatrzymać reakcje enzymatyczne. Gdy ostatnia próbka zostanie przefiltrowana, odwirować probówki i odessać supernatanty.

Aby usunąć mielinę z zawiesin komórkowych, należy dokładnie zawiesić granulki w 400 mikrolitrach buforu do usuwania mieliny i dodać odpowiednią ilość kulek do usuwania mieliny do każdej probówki. Pipetować roztwory w górę i w dół, aż komórki i kulki dokładnie się wymieszają. Następnie inkubować próbkę w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 15 minut. Po inkubacji przemyć każdą próbkę w 5 mililitrach buforu do usuwania mieliny.

Podczas obracania się komórek umieść jedną kolumnę dla każdej próbki w polu magnetycznym sortownika magnetycznego i umieść czysty filtr o średnicy 80 mikronów na górze każdej kolumny. Przepłucz każdy filtr i kolumnę trzykrotnie 1 mililitrem buforu do usuwania mieliny, zbierając cały przepływ do pojemnika na odpady.

Po ostatnim płukaniu umieść 5-mililitrowe rurki z okrągłym dnem z polistyrenu bezpośrednio pod każdą kolumną, aby zebrać eluat. Następnie odessać supernatant z próbek i ponownie zawiesić granulki w 500 mikrolitrach buforu do usuwania mieliny.

Natychmiast nałóż zawiesiny komórek na kolumny, zbierając komórki w probówkach poniżej. Następnie przepłucz każdy filtr i kolumnę 4 razy 1 mililitrem buforu do usuwania mieliny na mycie. Po ostatnim płukaniu odwirować komórki i odessać supernatanty.