JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:10 min • July 8th, 2025
Pobrać zawiesinę komórek uzyskanych z transgenicznych robaków Caenorhabditis elegans w pożywce hodowlanej.
Zawiesina zawiera komórki z różnych tkanek, w tym neurony z układu nerwowego.
Transgeniczne robaki zostały zmodyfikowane tak, aby wyrażały białko fluorescencyjne sprzężone z pęcherzykowym transporterem transbłonowym. Ten transporter, obecny na pęcherzykach synaptycznych przenoszących neuroprzekaźnik acetylocholinę, znajduje się w neuronach cholinergicznych w całym ciele.
Odwirować zawiesinę komórkową i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce hodowlanej w celu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją lub FACS.
Przeanalizuj zawiesinę komórek za pomocą FACS. Znakowane fluorescencyjnie neurony cholinergiczne emitują fluorescencję po wystawieniu na działanie światła o odpowiedniej długości fali, oddzielając je od innych nieznakowanych komórek.
Przenieś izolowane neurony na płytkę wielodołkową. Inkubuj komórki w wilgotnej komorze, aby utrzymać poziom wilgoci.
Odwirować komórki z izolowanej zawiesiny komórkowej pod ciśnieniem 10 000 g i w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki w pożywce uzupełnionej L-15 do gęstości komórek nie większej niż 6 milionów komórek na mililitr, aby uniknąć przeciążenia cytometru przepływowego. Następnie sortuj komórki według ekspresji GFP-dodatniej za pomocą cytometru przepływowego zdolnego do sortowania próbek.
Komórki GFP-ujemne mogą być używane jako kontrola do analizy niespecyficznej dla typu komórki. Następnie umieść izolowane komórki w dołkach sterylnej płytki sześciodołkowej. Umieść talerz w plastikowym pojemniku. Dodaj wilgotną chusteczkę lub miękką bibułkę, aby dodać wilgoci do komórek i inkubować w temperaturze 20 stopni Celsjusza.