Uzyskiwanie plastrów móżdżku z embrionalnego mózgu pisklęcia

Weź zapłodnione jajo kurze na odpowiednim etapie rozwoju.

Przetnij skorupę, aby uzyskać dostęp do zarodka.

Zlokalizuj i wypreparuj głowę, a następnie przenieś ją na szalkę Petriego zawierającą schłodzony bufor fosforanowy.

Usuń oczy i szczęki.

Oddziel skórę od powierzchni czaszki.

Następnie wytnij i usuń kości czaszki.

Oczyść otaczającą tkankę łączną, aby odsłonić mózg.

Oddziel przodomózgowie.

Następnie odłącz móżdżek od tyłomózgowia i naczynia krwionośnego.

Przenieś móżdżek do schłodzonego buforu solnego.

Móżdżek embrionalny zawiera warstwę szybko dzielących się neuronalnych komórek progenitorowych, co czyni go cennym dla badań neurogenezy.

Umieść móżdżek na platformie rozdrabniacza do tkanek.

Usuń nadmiar buforu i pokrój móżdżek.

Na plastry połóż schłodzony bufor soli.

Przenieś plastry móżdżku na szalkę Petriego zawierającą schłodzony bufor soli.

Pod mikroskopem oddziel poszczególne plasterki do dalszej analizy.

Na początek umieść zapłodnione brązowe jaja kurze w inkubatorze jaj w temperaturze 38 stopni Celsjusza, aż osiągną 14 dzień embrionalny. W 14 dniu embrionalnym wytnij otwór w jaju, aby odsłonić zarodek i odetnij głowę zarodkowi pisklęcia in ovo. Umieść głowę na szalce Petriego zawierającej lodowaty PBS.

Pod mikroskopem preparacyjnym użyj standardowych kleszczy, aby wykonać nacięcie za każdym okiem, przez całą tkankę i usuwając oczy i górną szczękę. Następnie wykonaj drugie nacięcie przez gardło, aby usunąć dolną szczękę. Następnie za pomocą standardowych kleszczy usuń skórę z powierzchni czaszki, odrywając ją. Następnie usuń kości czołowe i ciemieniowe, odsłaniając mózg.

Od strony brzusznej usuń chrząstkę gardłową i mezenchymę pomocniczą. Następnie umieść mózg grzbietową stroną do góry i ostrożnie usuń mezenchymę, grzbietowo do tyłomózgowia, uważając, aby nie uszkodzić pia. Następnie wykonaj nacięcie przez całą długość tkanki między śródmózgowiem a tyłomózgowiem, aby odłączyć tyłomózgowie, w tym móżdżek. Wykonaj nacięcia na całej długości tkanki zarówno w bocznych połączeniach móżdżku, jak i na płytce alar tyłomózgowia. Usuń cały móżdżek, zwracając uwagę na zachowanie integralności pia podczas sekcji.

Na koniec usuń tworzący się splot naczyniówkowy i przenieś wypreparowany móżdżek do lodowatego HBSS. Przenieś cały móżdżek na sterylną platformę rozdrabniacza tkanek za pomocą szpatułki lub 3-mililitrowej pipety Pasteura z odciętą końcówką w celu poszerzenia otworu. Usuń nadmiar płynu za pomocą pipety.

Ustaw prędkość cięcia rozdrabniacza tkanek na 50% jej wartości maksymalnej. Następnie przetnij móżdżek w wymaganej orientacji na grubość 300 mikrometrów. Za pomocą 3-mililitrowej pipety Pasteura przykryj pokrojony móżdżek zimnym HBSS.

Następnie przenieś HBSS i plastry na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 20 mililitrów lodowatego HBSS, używając 3-mililitrowej pipety Pasteura z odciętą końcówką. Umieść szalkę Petriego pod mikroskopem preparacyjnym, oświetlonym światłowodowym źródłem światła. Następnie użyj kleszczyków zegarmistrzowskich, aby oddzielić poszczególne wycinki tkanki mózgowej.