Ustanawianie pierwotnych mieszanych kultur komórek glejowych z rdzenia kręgowego myszy

Zbierz rdzeń kręgowy myszy i pokrój je na fragmenty.

Przenieś fragmenty do probówki zawierającej enzym proteolityczny i DNazę. Wirować i inkubować.

Enzym trawi macierz zewnątrzkomórkową tkanki, podczas gdy DNaza degraduje zanieczyszczające wolne DNA.

Ponownie wirować i wielokrotnie pipetować, aby zakończyć dysocjację tkanek, uzyskując zawiesinę jednokomórkową.

Odwirować i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w roztworze zawierającym DNazę i inhibitor proteazy i wirować. Inhibitor neutralizuje enzym.

Na wierzch nałożyć świeży roztwór inhibitora, odwirować i usunąć supernatant.

Ponownie zawiesić komórki w pożywce o gradiencie gęstości, wirować, a następnie odwirować.

Komórki osiadają na dole, podczas gdy resztki mieliny pozostają na górze.

Wyrzuć zanieczyszczenia. Kilkakrotnie przemyć buforem, odwirować i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w pożywce wzrostowej.

Ułóż komórki na płytce. Niepowlekana powierzchnia ułatwia przyczepianie się komórek glejowych.

Usuń zużytą pożywkę i dodaj świeżą pożywkę, aby indukować proliferację komórek glejowych, tworząc mieszaną kulturę glejową.

Pracując w kapturze do hodowli tkankowej, przenieś cztery rdzenie kręgowe myszy na szalkę Petriego HBSS. Użyj sterylnych nożyczek i kleszczy, aby przeciąć każdy z rdzeni kręgowych na małe kawałki. Następnie przenieś kawałki do 50-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej mieszaninę enzymów DNazy papainy. Należy unikać przenoszenia HBSS do mieszaniny enzymów, ponieważ może to spowodować zmniejszenie wydajności enzymu.

Bardzo ważne jest, aby fragmenty tkanek były dobrze trawione, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Jednak nadmierne trawienie spowoduje zmniejszenie liczby żywotnych komórek. Każde laboratorium musi przeprowadzić testy pilotażowe, aby określić dokładny czas trawienia w oparciu o to, co działa najlepiej dla ich komórek.

Następnie delikatnie zawiruj rurkę, a następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę z wytrząsaniem orbitalnym z prędkością 150 obrotów na minutę. Po inkubacji należy zawirować probówkę, a następnie energicznie rozcierać tkankę za pomocą pipety o pojemności 5 mililitrów, aby przyspieszyć dalszą dysocjację. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki i odwiruj przy 300 razy g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.

Podczas wirowania dodać 300 mikrolitrów odtworzonego roztworu inhibitora albuminy owomkoidów do 2,7 mililitra EBSS w sterylnej probówce i dobrze wymieszać. Następnie dodaj 150 mikrolitrów roztworu DNazy. Po odwirowaniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w świeżo przygotowanym inhibitorze albuminy i roztworze DNazy. Dobrze wywiruj, aby rozbić osad komórkowy.

Następnie dodać 3 mililitry odtworzonego roztworu inhibitora albuminy ovomukoid bez DNazy do zawiesiny komórkowej. Odwirować komórki w temperaturze 70 razy g przez 6 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu usunąć supernatant zawierający fragmenty błony i zachować osad.

Aby usunąć mielinę ze zdysocjowanych komórek rdzenia kręgowego, najpierw dodaj 8 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości o temperaturze pokojowej 20% do probówki zawierającej osad komórkowy i delikatnie przemieszaj. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 800 razy g przez 30 minut w temperaturze pokojowej bez pękania. Po odwirowaniu ostrożnie odessać wierzchnią warstwę gruzu, która zawiera głównie mielinę, oraz supernatant opuszczający osad.

Aby usunąć pozostały gradient gęstości, umyj ogniwa, ponownie zawieszając osad z 8 mililitrami cDMEM rozcieńczonym HBSS. Odwirować komórki o masie 400 g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Usunąć supernatant i przemyć komórki rozcieńczonym cDMEM, jak poprzednio.

Po usunięciu supernatantu osad można przechowywać na lodzie do czasu wysiewu komórek. Gdy będą gotowe do posiewu, ponownie zawieś komórki w 14 mililitrach cDMEM uzupełnionym 2-merkaptoetanolem i dodaj 1 mililitr zawiesiny komórek do każdej studzienki na 12-dołkowej płytce.

Płytki dodatkowe studzienki, które można wykorzystać do określenia średniej liczby komórek w basenie oraz zawartości mikrogleju w kulturze. Po pokryciu komórek inkubuj je w temperaturze 35,9 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Zmień podłoże w dniu 1, czyli dzień po poszyciu.

Niektóre komórki są przyczepione do płytki hodowlanej, ale nadal są w większości okrągłe. Jest też wiele pływających komórek i znaczne śmieci. Powtórz zmianę podłoża trzy do czterech dni później.