Różnicowanie unieśmiertelnionych multipotencjalnych progenitorów otycznych w neurony zwojowe spiralne i ocena różnicowania

Pobrać płytkę wielodołkową zawierającą sterylne szkiełka nakrywkowe pokryte substratem do hodowli komórkowych.

Wprowadź unieśmiertelnione multipotencjalne komórki progenitorowe lub iMOP w pożywce różnicowania neuronów.

iMOPy są prekursorami różnych komórek ucha wewnętrznego, w tym neuronów spiralnych zwojowych (SGN), które przekazują informacje słuchowe do mózgu.

Inkubować, pozwalając komórkom przylegać do substratu. Pożywka indukuje różnicowanie iMOPów w SGN.

Dodaj utrwalacz, aby indukować sieciowanie białek, zachowując morfologię komórek, oraz roztwór detergentu, aby przepuszczalnie błony komórkowe.

Wprowadzić odczynnik blokujący, aby zapobiec niespecyficznemu etykietowaniu.

Dodać przeciwciała sprzężone z fluoroforem specyficzne dla markerów różnicowania neuronów i inkubować, umożliwiając przeciwciałom znakowanie SGN.

Przemyć w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał i zamocować szkiełka nakrywkowe za pomocą podłoża mocującego zawierającego fluorescencyjne barwienie jądrowe.

Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej wykryj sygnały przeciwciał, aby potwierdzić różnicowanie iMOPs w SGN.

Najpierw wyczyść okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe, umieszczając je na sterylnej 100-milimetrowej płytce i zanurzając w 70% etanolu. Delikatnie potrząśnij szkiełkami nakrywkowymi, aby upewnić się, że są przykryte i pozostaw naczynie w temperaturze pokojowej na 10 minut. Następnie spłucz szkiełka nakrywkowe trzy razy w sterylnym 1x PBS, a następnie raz sterylną wodą.

Następnie pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia, wystawiając je na działanie światła UV w kapturze do hodowli tkankowych przez 15 minut. Przed natychmiastowym użyciem umieścić po jednym sterylnym szkiełku nakrywkowym w każdym dołku płytki 24-dołkowej i delikatnie potrząsnąć płytką, aby upewnić się, że wszystkie szkiełka nakrywkowe leżą płasko. Następnie pokryj szkiełka nakrywkowe, dodając 0,25 mililitra 1x PBS zawierającego 10 mikrogramów na mililitr poli-D-lizyny do każdego dołka.

Po inkubacji płytki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, usuń roztwór poli-D-lizyny i umyj studzienki trzykrotnie sterylnym 1x PBS. Po zassaniu płynu z ostatniego płukania wprowadź 0,25 mililitra 1x PBS zawierającego 10 mikrogramów na mililitr lamininy do każdej z 24 studzienek. Po inkubacji płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza odessać roztwór lamininy. Następnie umyj każdą studzienkę trzykrotnie 1 mililitrem 1x PBS, ale pozostaw PBS z ostatniego płukania w studzienkach, aż komórki będą gotowe do platerowania.

Aby rozpocząć różnicowanie neuronów, policz komórki ze zdysocjowanych otosfer, jak opisano wcześniej, a następnie ponownie je zawiesić we wstępnie podgrzanym pożywce różnicowania neuronów. Kontynuuj, wysiewając od 1 do 1,5 x 10⁵ komórek iMOP do każdego dołka płytki zawierającej powlekane szkiełka nakrywkowe. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, zastępując pożywkę różnicującą neurony co drugi dzień.

Po siedmiu dniach odessać pożywkę i utrwalić komórki, które powinny być przymocowane do szkiełek nakrywkowych, dodając 4% formaldehydu do każdej studzienki i pozostawiając je na 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie usuń formaldehyd i umyj komórki raz w 1x PBS zawierającym 0,1% Triton X-100. Następnie usuń bufor do przemywania i dodaj bufor blokujący składający się z 1x PBS zawierającego 10% normalnej surowicy koziej i 0,1% Triton X-100 do każdej studzienki.

Pozostawić komórki na godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć płyn i zastąpić go buforem blokującym zawierającym odpowiednie rozcieńczenie przeciwciała Cdkn1b lub Tubb3. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 4 stopni Celsjusza przemyj komórki raz 1x PBS zawierającym 1% Triton X-100, a następnie kontynuuj barwienie immunologiczne zgodnie z wcześniejszym opisem. Po zakończeniu barwienia wykonaj końcowe mycie, dodając 1x PBS do studzienek.

Aby przygotować je do analizy, należy usunąć szkiełka nakrywkowe, do których przymocowane są komórki barwiące z płytki 24-dołkowej i umieścić je na podłożu montażowym na szkiełku podstawowym. Po pozostawieniu podłoża montażowego do wyschnięcia przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza, uzyskaj obrazy epifluorescencji, jak opisano wcześniej.