Hodowla ex vivo i obrazowanie wycinków okoruchowych z transgenicznych zarodków myszy

Weź transgeniczną ciężarną mysz, chirurgicznie odizoluj macicę zawierającą zarodki i umyj ją, aby usunąć resztki krwi.

Usuń zarodki zawierające znakowane fluorescencyjnie neurony ruchowe i przenieś je na pokrywę płytki wielodołkowej.

Dodaj stopioną agarozę i ostudź pokrywkę, aby wywołać tworzenie się żelu, osadzając zarodki.

Pod mikroskopem fluorescencyjnym ustaw jądra okoruchowe i oczy w linii i przytnij agarozę równolegle do linii.

Utrwal zarodek na etapie próbki i umieść go w komorze wibratomu wypełnionej zimnym buforem do krojenia.

Za pomocą wibratomu wygeneruj plasterki zawierające jądra okoruchowe i oczy. Jądra tworzą nerwy okoruchowe, które kontrolują ruch gałek ocznych.

Przenieść plastry na wkładki hodowlane wewnątrz płytki wielodołkowej zawierającej pożywkę hodowlaną i inkubować.

Używając mikroskopu fluorescencyjnego, wykonuj obraz w regularnych odstępach czasu, aby obserwować znakowane fluorescencyjnie neurony okoruchowe rozciągające aksony, aby dotrzeć do oczu.

Przed rozpoczęciem zabiegu należy najpierw potwierdzić ciążę za pomocą USG w 10,5 dniu zarodka od krycia czasowego. Zbierz zarodki, spryskaj brzuch ciężarnej myszy 70% etanolem i użyj nożyczek, aby otworzyć jamę brzuszną, aby usunąć macicę. Umyj macicę na szalce Petriego z lodowatym HBSS przed umieszczeniem narządu na drugiej szalce Petriego ze świeżym, lodowatym HBSS.

Pod mikroskopem preparacyjnym usuń zarodki z rogu macicy i ich poszczególnych worków owodniowych, umieszczając każdy zarodek na spodniej stronie pokrywy 12-dołkowej płytki na lodzie podczas ich pobierania. Użyj bibuły filtracyjnej, aby usunąć wszelkie płyny otaczające każdy zarodek bez dotykania samych zarodków i zanurz zarodki w płynnej 4% niskotopliwej agarozie.

Umieść pokrywkę talerza na lodzie, aby zestalić agarozę. Gdy agaroza stwardnieje, odwróć zarodki i przykryj drugą stronę każdej próbki dodatkową agarozą. Gdy druga objętość agarozy zastygnie, użyj fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, aby przyciąć agarozę wokół każdego zarodka, tak aby każdy zarodek był prawidłowo zorientowany na etapie wibratomu.

Jądra okoruchowe i wczesne wyrostki aksonów powinny być fluorescencyjne. Wyrównaj każdy zarodek tak, aby jądro, wychodzące aksony i oko tworzyły linię i użyj żyletki, aby przyciąć agarozę równolegle do tej linii. Następnie napełnij komorę wibratomu lodowatym buforem do plastrów i przyklej pierwszy zarodek do etapu wibratomu, tak aby ostrze było równoległe do jądra okoruchowego i oczu.

Gdy super klej wyschnie, zanurz stopień wibratomu tak, aby zarodek był skierowany w stronę przeciwną do ostrza, i użyj nowego ostrza wibratonowego, aby uzyskać plastry o wielkości od 400 do 450 mikrometrów. Użyj sterylnej pipety transferowej, aby przenieść każdą warstwę do zimnego buforu do krojenia w miarę jej pozyskiwania, a następnie użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby wybrać plasterek zawierający jądra okoruchowe i oczy.

Za pomocą sterylnej pipety transferowej przenieś plasterek na hodowlę komórkową, włóż do 6-dołkowej płytki zawierającej 1,5 mililitra pożywki hodowlanej na dołek i umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń pozostałą agarozę z dolnego stadium i przyklej następny zarodek do etapu, kontynuując zbieranie plasterków, aż wszystkie zarodki zostaną pocięte i platerowane, a następnie obraz plasterków co 30 minut za pomocą kontrastu fazowego i mikroskopii fluorescencyjnej przez okres do 72 godzin.