JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:15 min • July 8th, 2025
Zacznij od płytki wielodołkowej zawierającej indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste lub iPSC w pożywce z inhibitorem kinazy Rho, który wspomaga przeżycie komórek.
Zastąp pożywkę niezbędną pożywką zawierającą składniki odżywcze i czynniki wzrostu.
Inkubować, aby umożliwić proliferację i różnicowanie iPSC w komórki prekursorowe.
Zastąp tę pożywkę pożywką różnicującą uzupełnioną czynnikami wzrostu fibroblastów i kwasem retinowym, a następnie inkubuj.
Czynniki wzrostu ułatwiają różnicowanie komórek prekursorowych w mikronaczyniowe komórki śródbłonka, podczas gdy kwas retinowy sprzyja syntezie białek połączeń ścisłych.
Umyj i potraktuj komórki roztworem enzymu-EDTA, aby odłączyć komórki, tworząc zawiesinę jednokomórkową.
Odwirować w celu zebrania komórek i usunięcia supernatantu. Następnie ponownie zawieś komórki w świeżej pożywce różnicowej.
Zasiaj tę zawiesinę komórkową w wielodołkowej płytce pokrytej kolagenem i białkami adhezyjnymi.
Inkubuj, aby umożliwić adhezję komórek, tworząc ścisłe połączenia między komórkami, przypominające komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu.
Aby indukować różnicowanie BMEC od ludzkich iPSC, należy przemyć zlewającą się kulturę iPSC jednokrotnie DPBS przed inkubacją komórek z odpowiednią objętością enzymatycznego EDTA przez około pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po uzyskaniu zawiesiny jednokomórkowej należy zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości pożywki z komórek macierzystych, uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem ROCK do liczenia.
Rozcieńczyć komórki do stężenia 1,56 razy 10 do czwartego na centymetr sześcienny i zasiać 2 mililitry komórek w indywidualnych dołkach 6-dołkowego płaskiego dna. Po 24 godzinach w inkubatorze do hodowli komórkowych zastąpić supernatant w każdym dołku pożywką E6 i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na kolejne cztery dni.
Aby oczyścić BMEC pochodzące z iPSC, pokryj płytki hodowlane odpowiednią objętością świeżo przygotowanego roztworu kolagenu IV i fibronektyny na dołek i inkubuj płytki przez co najmniej dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
W 6 dniu różnicowania zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w odpowiedniej objętości świeżej pożywki wolnej od ludzkiej surowicy śródbłonka uzupełnionej witaminą B27, podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów i kwasem retinowym. Umieść komórki w każdym dołku 24-dołkowej płytki o płaskim dnie pokrytej kolagenem i fibronektyną.