Generowanie chipa bariery krew-mózg przy użyciu komórek prekursorowych pochodzących z iPSC

Weźmy chip mikroprzepływowy z nałożonymi na siebie kanałami pokrytymi matrycą oddzielonymi porowatą membraną.

Nasiona nerwowych komórek progenitorowych pochodzących z iPSC w górnym kanale. Inkubować w celu przylegania komórek, a następnie umyć, aby usunąć nieprzyłączone komórki.

Następnie wysiewaj komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu pochodzące z iPSC w dolnym kanale.

Odwróć chip i inkubuj go, aby przymocować komórki śródbłonka do strony błony dolnego kanału.

Następnie odwróć chip, aby przymocować komórki do dolnej części kanału, tworząc jednowarstwową strukturę przypominającą rurkę. Umyj oba kanały mediami specyficznymi dla komórek.

W sposób ciągły przepływa ośrodek różnicowania neuronalnego w górnym kanale i ośrodek komórek śródbłonka w dolnym kanale.

Komórki śródbłonka wykorzystują czynniki wzrostu od średniego do dojrzałego i tworzą ścisłe połączenia przypominające naczynie krwionośne, tworząc stronę krwionośną.

Czynniki neurotroficzne napędzają różnicowanie nerwowych komórek progenitorowych w różne komórki mózgowe, tworząc stronę mózgu. Komórki te oddziałują z komórkami śródbłonka, tworząc barierę krew-mózg na chipie.

Na początek przynieś naczynie zawierające przygotowane frytki do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą pipety P200 delikatnie umyj oba kanały, dodając 200 mikrolitrów pożywki różnicującej neurony do wlotu i wyciągając płyn z wylotu. Unikając kontaktu z portami, ostrożnie odessuj nadmiar kropelek nośnika z powierzchni chipa.

Delikatnie wstrząsnąć zawiesiną komórkową, aby zapewnić jednorodną zawiesinę komórek. Aby zasiać neuronalne komórki progenitorowe pochodzące z iPSC w górnym kanale w celu wygenerowania strony mózgu, dodaj końcówkę P200 zawierającą od 30 do 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej o stężeniu 1 x 10⁶ komórek na mililitr do wlotu górnego kanału i delikatnie zwolnij końcówkę z pipety.

Weź pustą pipetę P200, aby nacisnąć tłok, włóż do wylotu górnego kanału i ostrożnie przeciągnij zawiesinę jednokomórkową przez końcówkę. Przenieś chip do mikroskopu, aby sprawdzić gęstość wysiewu w jednorodnym rozmieszczeniu komórek w górnym kanale. Po potwierdzeniu gęstości komórek przy 20% pokryciu, natychmiast umieść chipsy w inkubatorze na dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie zmyj komórki, które się nie przyczepiają, dodając świeżą pożywkę różnicującą neurony do wlotu i zbierając płyn za pomocą pipety z wylotu. Utrzymuj komórki w warunkach statycznych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z codzienną wymianą pożywki różnicującej neurony. Po dołączeniu iNPC lub w następnym dniu po wysiewie, przynieś naczynie zawierające przygotowane chipsy do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Delikatnie umyj dolny kanał 200 mikrolitrami pożywki z komórek śródbłonka.

Unikając kontaktu z portami, ostrożnie odsysaj kropelki nadmiaru pożywki z komórek śródbłonka z powierzchni chipa, upewniając się, że pozostawiłeś pożywkę w obu kanałach. Delikatnie wstrząsnąć zawiesiną komórkową, aby zapewnić jednorodną zawiesinę komórek. Za pomocą pipety P200 pobrać od 30 do 100 mikrolitrów zawiesiny komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu pochodzącej z iPSC o stężeniu 14 do 20 x 10⁶ komórek na mililitr i umieścić końcówkę we wlocie dolnego kanału.

Najważniejszym krokiem do osiągnięcia funkcjonalnych właściwości barierowych jest wysiew komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu. Bardzo ważne jest, aby wysiewać komórki o odpowiedniej gęstości, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, aby zweryfikować jednorodne rozmieszczenie w osłonce narządu.

Wciśnij tłok pipety P200 z pustą końcówką, włóż do wylotu dolnego kanału i powoli zwolnij tłok pipety, aby ostrożnie przeciągnąć zawiesinę jednokomórkową przez dolny kanał. Odessać nadmiar zawiesiny komórek z powierzchni chipa. Unikaj bezpośredniego kontaktu z portami wlotowymi i wylotowymi, aby upewnić się, że żadna zawiesina komórek nie jest zasysana z kanałów. Przenieś wiór do mikroskopu, aby sprawdzić gęstość wysiewu.

Dolny kanał jest wypełniony komórkami bez widocznych przerw między nimi. Po potwierdzeniu prawidłowej gęstości komórek zasiej komórki w pozostałych wiórach. Aby przymocować komórki do porowatej membrany, która znajduje się na górze dolnego kanału, odwróć każdy chip i pozwól im spocząć w kołysce na wióry. Umieść mały zbiornik zawierający sterylny DPBS wewnątrz 150-milimetrowej naczynia, aby zapewnić wilgotność komórkom.

Inkubuj wióry w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około trzy godziny lub do momentu, gdy komórki w dolnym kanale się przyczepią. Po przyczepieniu się komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu pochodzących z iPSC, odwróć chipy z powrotem do pozycji pionowej, aby umożliwić przyczepienie się komórek do dolnej części dolnego kanału. 48 godzin po wysiewie mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu pochodzących z iPSC, zrównoważ temperaturę pożywki komórek śródbłonka, ogrzewając się w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę.

Następnie odgazować pożywkę przez inkubację w systemie filtracji napędzanym próżnią przez 15 minut. Następnie zdezynfekuj zewnętrzną część opakowania i tac modułu przenośnego 70% etanolem, wytrzyj i przenieś je do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Otwórz opakowanie i umieść moduły w tacy. Ustaw je tak, aby zbiorniki były skierowane z tyłu tacy. Odpipetować 3 mililitry wstępnie zbalansowanego ciepłego podłoża do każdego zbiornika wlotowego. Dodaj pożywkę do hodowli komórek śródbłonka do zbiornika wlotowego dolnego kanału i pożywkę różnicującą neurony do zbiornika wlotowego górnego kanału.

Następnie odpipetować 300 mikrolitrów wstępnie zbalansowanego ciepłego podłoża do każdego zbiornika wylotowego bezpośrednio nad każdym portem wylotowym. Umieść do 6 modułów przenośnych na każdej tacy. Przynieś tace do inkubatora i wsuń całkowicie do modułu hodowlanego z uchwytem tacki skierowanym na zewnątrz. Wybierz i uruchom cykl główny w module hodowli. Zamknij drzwiczki inkubatora i pozwól modułowi hodowlanemu zalać moduły przenośne przez około jedną minutę.

Cykl zalewania jest zakończony, gdy na pasku stanu pojawi się komunikat "Gotowy". Wyjmij tackę z modułu hodowli i przenieś ją do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Sprawdź spód każdego przenośnego modułu w szafie bezpieczeństwa biologicznego, aby upewnić się, że moduły przenośne zostały pomyślnie zalane. Poszukaj obecności małych kropelek we wszystkich czterech portach. Jeśli którykolwiek z modułów przenośnych nie pokazuje kropel, uruchom ponownie cykl główny na tych modułach. Jeśli jakikolwiek nośnik kapie na tacę, co zdarza się częściej przez porty wylotowe, wyczyść tacę 70% etanolem.

Następnie delikatnie umyj oba kanały każdego chipa ciepłym, zrównoważonym podłożem hodowlanym specyficznym dla komórek, aby usunąć wszelkie możliwe pęcherzyki w kanale, i umieść małe kropelki pożywki na górze każdego portu wlotowego i wylotowego. Włóż chipy z nośnikami do modułów przenośnych i umieść do sześciu na każdej tacy. Włóż tace do modułu hodowlanego. Zaprogramuj odpowiednie warunki hodowli chipów narządowych, takie jak szybkość przepływu i rozciąganie na module hodowli. Po zakończeniu cyklu regulacji, który trwa około dwóch godzin, rozpoczynają się zaprogramowane warunki. Następnie moduł hodowli zaczyna płynąć w zadanych warunkach hodowli narząd-chip.