Infekowanie pierwotnych neuronów śródmózgowia myszy zmodyfikowanymi wirusami związanymi z adenowirusami

Zacznij od hodowli embrionalnych komórek śródmózgowia myszy na szkiełku nakrywkowym.

Leczenie zmodyfikowanymi wirusami związanymi z adenowirusami kodującymi fluorescencyjny kompleks wskaźnikowy wapnia pod promotorem specyficznym dla neuronów.

Inkubuj w celu przyczepienia się wirusa i internalizacji.

Usuń pożywkę, aby wyeliminować niezwiązane wirusy, a następnie dodaj pożywkę hodowlaną i inkubuj.

Zinternalizowane wirusy uwalniają swój genom w jądrze, gdzie specyficzny dla neuronu promotor napędza produkcję kompleksów wskaźnikowych wapnia wyłącznie w neuronach pierwotnych.

Kompleksy te obejmują białko fluorescencyjne znakowane białkiem wiążącym wapń i peptyd M13.

Przenieś szkiełko nakrywkowe do naczynia z buforem rejestrującym bogatym w jony wapnia, a następnie umieść je w komorze rejestrującej w celu obrazowania konfokalnego na żywo.

Wprowadź bufor rejestrujący glutaminian, powodując wiązanie glutaminianu z kanałami jonowymi, co prowadzi do wnikania jonów wapnia.

Jony te wiążą się z kompleksem, powodując zmianę konformacyjną i emisję fluorescencji.

W obrazowaniu na żywo jasne neurony wskazują na infekcję wirusową.

Zacznij od przygotowania 1 mililitra pożywki DMEM bez surowicy z 1 mi