Rozwój i utrzymanie ciał zarodkowych wolnych od surowicy

Zacznij od studzienki zawierającej nerwową komórkę progenitorową lub agregaty NPC w pożywce różnicującej-1 lub DM-1.

Te NPC są prekursorami linii neuronalnej generowanej z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub hiPSC przy użyciu DM-1 w kontrolowanych warunkach.

Przenieś agregaty NPC na wkład membranowy umieszczony w studzience zawierającej DM-1 i usuń nadmiar pożywki.

Zmień pożywkę na DM-2 i inkubuj.

DM-2 dostarcza składników odżywczych i czynników różnicujących, które sprzyjają dojrzewaniu NPC do różnych typów komórek nerwowych.

Niezróżnicowane NPC przekształcają się w ciała embrionalne, znane jako ciała embrionalne wolne od surowicy lub SFEB, ponieważ pożywka nie ma surowicy. Te EB przypominają morfologię rozwijającego się mózgu.

Przenieść wkładkę do studzienki zawierającej DM-3.

DM-3 zawiera czynniki wzrostu niezbędne do utrzymania i wzrostu SFEB.

Inkubować, aż SFEB osiągną pożądany rozmiar.

Po dwóch tygodniach hodowli komórek przygotuj sześciodołkowe płytki z 40-mikronowymi wkładkami do hodowli komórkowych i 1 mililitrem pożywki DM1. Inkubować te płytki przez co najmniej cztery godziny przed dodaniem hodowanych komórek.

Następnie, za pomocą końcówki do pipet o pojemności 200 mikrolitrów z szeroką szyjką, zbierz dwutygodniowe agregaty komórek z około 20 mikrolitrami pożywki. Przenieś od czterech do sześciu kruszyw na każdą wkładkę przy minimalnym roztworze. Usuń nadmiar.

Na tym etapie ważne jest, aby pracować szybko i pewną ręką. Podczas usuwania pożywki z okolic SFEB można zauważyć, że SFEB przemieszczają się w poprzek roztworu z powodu napięcia powierzchniowego. Można je ponownie ustawić po usunięciu nośnika.

Gdy wszystkie agregaty zostaną załadowane na wkładki, zmień pożywkę na 1 mililitr DM2 i kontynuuj hodowlę komórek. Co drugi dzień wymieniaj 3/4 pożywki na świeżą pożywkę. Po 14 dniach hodowli zacznij dodawać pożywkę DM3 do kultur. Kontynuuj hodowlę przez kolejne 16 dni, aby wyhodować SFEB.