Generowanie modelu 3D kokultury ludzkich fibroblastów i neuronów rogówki

Weźmy ludzkie fibroblasty rogówki.

Przenieś je do wkładki membranowej w wielodołkowej płytce zawierającej pożywkę.

Dodaj nośnik do wkładu membranowego. Inkubować w celu przylegania fibroblastów do wkładki.

Następnie zastąp pożywkę pożywką zawierającą witaminę C we wkładzie membranowym i zbiorniku.

Inkubować. Witamina C stymuluje fibroblasty do wydzielania i składania trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej

.

Dodaj zawiesinę ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego na fibroblasty.

Inkubować, umożliwiając adhezję komórek nerwiaka zarodkowego.

Teraz dodaj pożywkę zawierającą kwas retinowy na komórki i uzupełnij zbiornik świeżą pożywką.

Inkubować. Kwas retinowy wyzwala różnicowanie komórek nerwiaka zarodkowego w nerwowe komórki progenitorowe.

Następnie wyjmij nośnik. Wprowadź świeże podłoże do zbiornika. Dodać pożywkę zawierającą czynnik neurotroficzny do wkładu błonowego i przeprowadzić inkubację.

Czynniki neurotroficzne wywołują różnicowanie komórek progenitorowych w neurony, generując model 3D wspólnej hodowli ludzkich fibroblastów i neuronów rogówki.

Aby złożyć konstrukcje 3D, najpierw przejdź i policz ludzkie fibroblasty rogówki. Następnie wysiewaj około 1 razy 10 do 6 HCF na wkładce z membrany poliwęglanowej z porami 0,4 mikrona. Dodaj 1,5 mililitra świeżej pożywki na wierzch konstruktu. Następnie odpipetuj kolejne 1,5 mililitra tego samego podłoża na dno każdej konstrukcji.

Po 24 godzinach dodaj 1,5 mililitra pożywki uzupełnionej 0,5 milimolową witaminą C na górę i dół każdego konstruktu. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez trzy tygodnie, dodając świeżą pożywkę zawierającą witaminę C co drugi dzień. To pobudzi komórki do wydzielania i składania własnej macierzy zewnątrzkomórkowej. Po trzech tygodniach dodaj 8 razy 10 do 3 ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y na wierzchu wcześniej zmontowanych konstruktów 3D.

Bardzo ważne jest, aby na tym etapie obliczyć dokładną liczbę komórek i odczekać 24 godziny przed rozpoczęciem różnicowania komórek.

Po 24 godzinach inkubacji zainicjuj różnicowanie komórek SH-SY5Y poprzez stymulację komórek 1,5 mililitra EMEM z 10% FBS i 10 mikromolowym kwasem retinowym. Następnie dodaj 1,5 mililitra pożywki zawierającej witaminę C na dno konstruktu. Kwas retinowy jest wrażliwy na światło, więc ten krok należy wykonywać w ciemności.

Po pięciu dniach, gdy komórki osiągnęły fazę różnicowania, dodaj 1,5 mililitra pożywki bez surowicy zawierającej 2 nanomolowe BDNF i 1% antybiotyku przeciwgrzybiczego do wierzchu konstruktu. Dodaj świeżą pożywkę z dodatkiem witaminy C na dno konstruktu. Hodować komórki przez dodatkowe dwa dni przed przetworzeniem do dalszej analizy.