JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:57 min • July 8th, 2025
Weźmy komórki zwojowe siatkówki danio pręgowanego hodowane na powlekanych szkiełkach nakrywkowych.
Komórki te wyrażają genetycznie zakodowany bioczujnik, który wytwarza wrażliwe na redoks zielone białko fluorescencyjne roGFP2 połączone z wrażliwym na nadtlenek wodoru enzymem Orp1.
Przenieś szkiełko nakrywkowe z pożywką do komory obrazowania żywych komórek i umieść komorę w odwróconym mikroskopie.
Zastąp pożywkę pożywką niezawierającą surowicy, aby zmniejszyć fluorescencję tła.
Ze względu na niski poziom nadtlenku wodoru, roGFP2 pozostaje w zmniejszonej konformacji.
Wzbudzaj bioczujnik sekwencyjnie na długościach fal 405 i 480 nm.
Zredukowany roGFP2 wykazuje pik wzbudzenia przy 480 nm.
Przełącz się na medium zawierające nadtlenek wodoru.
Nadtlenek wodoru dostaje się do komórek i reaguje z Orp1, utleniając roGFP2.
Ponownie wzbudz bioczujnik.
Utleniony roGFP2 wykazuje wzrost fluorescencji przy 405 nm i spadek przy 480 nm.
Obliczyć współczynnik intensywności fluorescencji.
Wzrost współczynnika wskazuje na zwiększony poziom komórkowego nadtlenku wodoru.
W dniu obrazowania sprawdź komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić wzrost aksonów RGC. W przypadku obrazowania żywych komórek przenieś szkiełka nakrywkowe z naczynia hodowlanego do komory obrazowania żywych komórek. Użyj odwróconego mikroskopu wyposażonego w obiektyw DIC, długoprzepustowy filtr czerwony OG590 i kamerę EM-CCD.
Przed obrazowaniem należy wymienić pożywkę ZFCM+ na ZFCM-. Po ustawieniu komórek za pomocą obiektywu 10x, uzyskaj obrazy w powiększeniu 60x za pomocą obiektywu immersyjnego z olejkiem. Użyj dodatkowego powiększenia 1,5x.
Najpierw należy pozyskać obrazy DIC, a następnie zobrazować roGFP2-Orp1 za pomocą odpowiedniego zestawu filtrów. Po wykonaniu pierwszego zestawu obrazów należy wymienić pożywkę na pożywkę zawierającą różne roztwory do obróbki. Pożywki należy wymieniać co 30 minut obrazowania, aby uniknąć zmian pH i osmolarności.