JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:57 min. • July 8th, 2025
Weźmy komórki zwojowe siatkówki danio pręgowanego hodowane na powlekanych szkiełkach nakrywkowych.
Komórki te wyrażają genetycznie zakodowany bioczujnik, który wytwarza wrażliwe na redoks zielone białko fluorescencyjne roGFP2 połączone z wrażliwym na nadtlenek wodoru enzymem Orp1.
Przenieś szkiełko nakrywkowe z pożywką do komory obrazowania żywych komórek i umieść komorę w odwróconym mikroskopie.
Zastąp pożywkę pożywką niezawierającą surowicy, aby zmniejszyć fluorescencję tła.
Ze względu na niski poziom nadtlenku wodoru, roGFP2 pozostaje w zmniejszonej konformacji.
Wzbudzaj bioczujnik sekwencyjnie na długościach fal 405 i 480 nm.
Zredukowany roGFP2 wykazuje pik wzbudzenia przy 480 nm.
Przełącz się na medium zawierające nadtlenek wodoru.
Nadtlenek wodoru dostaje się do komórek i reaguje z Orp1, utleniając roGFP2.
Ponownie wzbudz bioczujnik.
Utleniony roGFP2 wykazuje wzrost fluorescencji przy 405 nm i spadek przy 480 nm.
Obliczyć współczynnik intensywności fluorescencji.
Wzrost współczynnika wskazuje na zwiększony poziom komórkowego nadtlenku wodoru.
W dniu obrazowania sprawdź komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić wzrost aksonów RGC. W przypadku obrazowania żywych komórek przenieś
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych