Elektrofizjologiczny zapis napięciowych odpowiedzi fotoreceptorów siatkówki Drosophila na bodźce świetlne

Zamontuj muchę Drosophila na uchwycie z odsłoniętą głową.

Utwórz otwór w jednym oku i usuń rogówkę, aby odsłonić siatkówkę.

Umieść uchwyt na platformie nagrywającej.

Włożyć elektrodę referencyjną zawierającą fizjologiczny roztwór soli fizjologicznej do kapsułki głowy.

Następnie włóż ostrą elektrodę rejestrującą zawierającą wewnątrzkomórkowy roztwór naśladujący środowisko przez otwór do siatkówki.

Pozwól oku przystosować się do ciemności.

Zmierz rezystancję elektrody rejestrującej, aby upewnić się, że nadaje się do nagrywania.

Następnie wyeliminuj różnicę napięcia w linii podstawowej między elektrodą rejestrującą a elektrodą odniesienia.

Podczas adaptacji do ciemności specyficzne kanały jonowe w komórkach fotoreceptorów siatkówki pozostają otwarte, umożliwiając stały napływ jonów dodatnich.

Stymuluj oko za pomocą błysków światła.

W odpowiedzi kanały jonowe zamykają się, zmniejszając napływ jonów dodatnich i sprzyjając wypływowi.

W konsekwencji potencjał błonowy fotoreceptorów staje się bardziej ujemny, mierzony przez elektrodę rejestrującą jako spadek napięcia.

Podczas obsługi mikroelektrody amplifier, zawsze bądź uziemiony, dotykając metalowej powierzchni klatki Faradaya lub stołu antywibracyjnego, aby zapobiec ładunkom elektrostatycznym. Przymocuj zamontowaną muchę do słupa platformy do przygotowania much.

Obróć uchwyt na muchę tak, aby lewe oko muchy było skierowane bezpośrednio w stronę badacza. Następnie użyj małego, gruboziarnistego mikromanipulatora, aby delikatnie wprowadzić elektrodę referencyjną przez oczka muchy do torebki głowy. Upewnij się, że mucha nadal wydaje się zdrowa i porusza czułkami. Przygotowanie musi być doskonałe, aby zasługiwało na nagranie.

Teraz wbij ostrą mikroelektrodę rejestrującą do lewego oka przez otwór pokryty galaretką. Gdy wnika do tkanki, położenie końcówki elektrody powinno być widoczne dzięki jej wzorowi odbicia. Delikatna końcówka elektrody musi być idealnie prowadzona, w przeciwnym razie pęknie, co jest bardzo trudne.

W zależności od typu komórki, z której odbywa się nagranie, głowa muchy powinna być zorientowana nieco inaczej. Po umieszczeniu elektrod na miejscu włącz wzmacniacz mikroelektrodowy. Następnie wyłącz zimne źródło światła, odłącz je od sieci i podłącz do centralnego uziemienia, aby zminimalizować szumy elektryczne wywołane pętlą uziemienia.

Następnie wyreguluj światłowody na gęsiej szyi, aby system ramienia kardana można było swobodnie przesuwać wokół muchy. Następnie wyłącz światła w pomieszczeniu, aby umieścić preparat na muchy we względnej ciemności. Teraz zmierz rezystancję elektrody rejestrującej w oku. Musi wynosić od 100 do 250 megaomów.

Następnie ustaw wzmacniacz na cęgi prądowe lub mostek i wyzeruj napięcie między elektrodami. Po kilku minutach przystosowania muchy do ciemności, wbij końcówkę elektrody rejestrującej w oko w krokach co 0,1 do 1 mikrona za pomocą steppera piezoelektrycznego lub delikatnie obracając pokrętłem o precyzyjnej rozdzielczości.

Na każdym kroku stymuluj oko błyskiem światła od 1 do 10 milisekund. Każdy błysk światła spowoduje krótki spadek napięcia lub ERG.