Rejestrowanie prądów synaptycznych w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila

Umieść szalkę Petriego zawierającą wypreparowaną larwę Drosophila z odsłoniętymi mięśniami i gałęziami nerwowymi na stoliku mikroskopowym.

Włożyć elektrodę referencyjną do roztworu do kąpieli na szalce Petriego.

Napełnij elektrodę rejestrującą roztworem izotonicznym.

Za pomocą mikromanipulatora umieść tę elektrodę nad mięśniem brzucha unerwionym przez neurony ruchowe.

Umieść końcówkę elektrody na bulionie synaptycznym, strukturze na końcu aksonu zawierającej neuroprzekaźniki.

Stale rejestruj miniaturowe pobudzające prądy połączeniowe lub mEJC, które są reakcją na spontaniczne uwalnianie neuroprzekaźników.

Prawidłowy zakres amplitudy mEJC potwierdza prawidłowe ustawienie elektrody.

Następnie umieść elektrodę stymulacyjną w pobliżu aksonu, który unerwia docelowy mięsień.

Zastosuj podciśnienie, aby wciągnąć akson do wnętrza elektrody.

Stopniowo zwiększaj prąd stymulacji, aby indukować potencjał czynnościowy.

To powoduje, że akson uwalnia neuroprzekaźniki w połączeniu nerwowo-mięśniowym, które są rejestrowane jako prądy synaptyczne.

Umieść szalkę Petriego z preparatem na stoliku mikroskopowym. Włóż elektrodę odniesienia do kąpieli. Napełnij elektrodę rejestrującą roztworem HL3. Pod obiektywem 10x zanurz elektrodę w kąpieli i umieść ją na mięśniach 6 i 7 segmentów brzucha 2, 3 lub 4 za pomocą mikromanipulatora.

Następnie przełącz obiektyw na 60X i skup się na obszarze zainteresowania za pomocą optyki epi-florescencji lub DIC. Umieść końcówkę elektrody na szczycie synaptycznych butonów, a następnie bardzo delikatnie dociśnij elektrodę do mięśnia, ponieważ nadmierny nacisk może uszkodzić NMJ lub wywołać wzrost spontanicznej aktywności synaptycznej.

Następnie włącz wzmacniacz, płytę AD i komputer. Następnie wybierz tryb cęgów napięcia na wzmacniaczu. Uruchom oprogramowanie do akwizycji, wybierz tryb bez przerw i obserwuj wygląd mEJC na ekranie komputera. Upewnij się, że amplituda mEJC mieści się w zakresie od 0,2 do 0,7 nanoampera.

Za pomocą mikromanipulatora pod kontrolą wizualną umieść elektrodę stymulacyjnej w pobliżu aksonu unerwiającego segmenty brzucha od 2 do 4. Zastosować podciśnienie, pociągając za tłok strzykawki podłączonej do uchwytu elektrody, tak aby akson został wciągnięty do wnętrza elektrody.

Następnie włącz stymulator. Przekręć pokrętło na jednostce izolacyjnej, aby ustawić prąd zerowy, a następnie delikatnie go zwiększaj, aż pojawią się EJC lub do momentu osiągnięcia progu. Stymulację należy przeprowadzić w reżimie ponadprogowym, przy wzroście prądu stymulacji około dwukrotnie w porównaniu z progiem dla obserwacji EJC.