Name: Podskórne podawanie antagonistów muskaryny i potrójne barwienie immunologiczne mięśnia dźwigacza aury długiej u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Poznaj metodę podawania antagonistów muskaryny podskórnie w mięsień dźwigacz aury długiej u myszy oraz potrójne barwienie immunologiczne. Technika ta umożliwia badanie zmian morfologicznych złączy nerwowo-mięśniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana przez Muscular Dystrophy Association oraz NIH (NS062320).

1. Podskórne podawanie antagonistów muskarynowych receptorów acetylocholiny (mAChR)
<ol>
 <li>W warunkach aseptycznych przygotować odpowiednią dawkę antagonisty mAChR (por. tabela), rozpuszczając lek w sterylnym roztworze soli fizjologicznej w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. Wykorzystano następujące antagonisty: atropinę, metoktraminę, 4-DAMP, AFDX-16, AFDX-384 oraz MT 7. </li>
 <li>Rysuj 50μl roztworu do strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml i używaj osobnej strzykawki dla każdej myszy. Przygotuj również strzykawki zawierające wyłącznie sól fizjologiczną dla każdej myszy w grupie kontrolnej. Przechowuj strzykawki w lodzie do momentu wykonania wtryskiwania. </li>
 <li>Zanurzyć myszy w znieczuleniu za pomocą mieszaniny ketaminy i ksylazyny (120 mg/kg ketaminy, 8 mg/kg ksylazyny). Sprawdzić, czy osiągnięto odpowiednią głębokość znieczulenia, obserwując brak reakcji na uciśnięcie palca u stopy.</li>
 <li>Po zastosowaniu odpowiedniej sedacji należy ogolić włosy od przedniej części głowy do tylnej części szyi, a następnie usunąć pozostałe włosy za pomocą 70% etanolu. </li>
 <li>Umieść mysz pod stereomikroskopem i wprowadź igłę równolegle do mięśnia LAL, lekko odciągając tłok strzykawki (Ryc. 1A,B). Zapewnia to, że igła zostanie wprowadzona w znajdującą się powyżej tkankę łączną i nie uszkodzi bezpośrednio samego mięśnia LAL. Wprowadź igłę tak, aby jej końcówka pokrywała końcową część mięśnia LAL.</li>
 <li>Należy bardzo powoli zacząć wstrzykiwać roztwór nad prawy mięsień LAL, jednocześnie wycofując strzykawkę; całkowity czas wstrzykiwania powinien wynosić około 1 minuty. Przy prawidłowym wstrzyknięciu w skórze nad mięśniem powinien utworzyć się „kopułka” o średnicy około 1 cm, która utrzyma się przez co najmniej jedną godzinę. Jednolicie wstrzyknięty roztwór powinien pokryć całe obszary rostralny i kaudalny prawego mięśnia LAL. </li>
 <li>Powtarzać procedurę co 12 godzin przez okres od 1 do 7 dni. W innych badaniach1 zastosowano ten sam protokół w celu wstrzykiwania czynników wzrostu co 12 godzin przez okres do 21 dni. Nie zaobserwowano żadnych nieprawidłowych reakcji u myszy, którym podawano znieczulenie 2 razy dziennie przez okres do 21 dni.</li>
</ol>
2. Disekcja mięśni LAL
<ol>
 <li>Uśmierć myszy poprzez przedawkowanie pentobarbitalu sodowego (390 mg/kg). Śmierć potwierdza się poprzez stwierdzenie braku bicia serca po wykonaniu torakotomii.</li>
 <li>Przytwierdź mysz w naczyniu sekcyjnym, stroną grzbietową do góry, używając jednej szpilki w każdej łapie i jednej szpilki przez nos.</li>
 <li>Wykonaj pierwsze nacięcie tylko przez skórę, używając małych nożyczek sprężynowych, prowadząc cięcie wzdłuż lewego mięśnia LAL od obszaru bezpośrednio proksymalnie od ucha do obszaru wokół lewej łopatki.</li>
 <li>Ostrożnie usuń skórę w tym regionie, unikając cięcia zbyt blisko prawego ucha, ponieważ jest to jeden z punktów przyczepu prawego mięśnia LAL.</li>
 <li>Zlokalizuj centralnie położony pas tkanki tłuszczowej wzdłuż linii środkowej na powierzchni powierzchownej głowy, w miejscu styku prawego i lewego mięśnia LAL. Używając małych nożyczek sprężynowych, wykonaj nacięcie 1 cm na prawo od tkanki tłuszczowej (w stronę lewego ucha) od krawędzi proksymalnej lewego mięśnia LAL aż do łopatki (Ryc. 1C).</li>
 <li>Po wykonaniu nacięcia odsunij prawy mięsień LAL małą pęsetą, aby odsłonić jego stronę brzuszną. Usuń tkankę łączną i powięź, ostrożnie podciągając prawy mięsień LAL pęsetą (Ryc. 1C).</li>
 <li>Wytnij prawy mięsień LAL wokół jego końca ogonowego u nasady ucha. Kontynuuj cięcie, przesuwając się w stronę końca rostralnego prawego ucha, utrzymując prawy mięsień LAL w pozycji odwróconej (Ryc. 1C).. Na tym etapie lepiej pozostawić więcej tkanki, niż ryzykować uszkodzenie samego mięśnia LAL. Jeśli mięsień zacznie wysychać, nanieś pipetą 1X PBS na mięsień.</li>
 <li>Umieść wypreparowany prawy mięsień LAL stroną grzbietową do góry w 30-milimetrowej szalce hodowlanej Sylgard zawierającej 1X PBS. Przytwierdź cztery narożniki mięśnia za pomocą małych szpilek entomologicznych.</li>
 <li>Używając małej pęsety i nożyczek sprężynowych, oczyść tkankę łączną z powierzchni grzbietowej i brzusznej prawego mięśnia LAL. Odwróć mięsień i ponownie go przytwierdź, aby oczyścić powierzchnię brzuszną. W jednej 30-milimetrowej szalce można umieścić 2-3 mięśnie.</li>
</ol>
3. Potrójne barwienie immunocytochemiczne złączy nerwowo-mięśniowych LAL: Dzień 1
<ol>
 <li>Przed rozpoczęciem immunostainingu należy przygotować wszystkie niezbędne odczynniki. Wymagane będą: 1X PBS, 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)/PBS, 0,1M glicyny w 2% BSA/PBS, 0,2% Triton X10 w 2% BSA/PBS oraz 4% paraformaldehydu (PFA) w 1X PBS. Metanol należy schłodzić w zamrażarce w temperaturze -20°C. </li>
 <li>Podczas tego procesu mięśnie LAL powinny pozostać przypięte w naczyniu stroną grzbietową do góry. Odlać roztwór 1X PBS i dodać odpowiednią ilość 4% (PFA), aby pokryć mięsień. Naczynie umieścić na wytrząsaniu ustawionym na prędkość 2 lub 3 na 20 minut. O ile nie zaznaczono inaczej, w kolejnych krokach naczynie powinno znajdować się na wytrząsarce. </li>
 <li>Odlać 4% PFA i przemyć mięsień 1X PBS trzykrotnie, po 10 minut każdy raz. </li>
 <li>Odlać ostatni przemywany roztwór 1X PBS i dodać roztwór 0,1M glicyny w 2% BSA/PBS na 30 minut. </li>
 <li>Odlać roztwór 0,1M glicyny i dodać 1X PBS zawierający $\alpha$-bungarotoksynę sprzężoną z rodamyną w stężeniu 1:20 na 15 minut.</li>
 <li>Odlać roztwór $\alpha$-bungarotoksyny i przemyć mięsień w 1X PBS trzykrotnie, po 10 minut każdy raz. </li>
 <li>Przeprowadzić permeabilizację tkanki, dodając schłodzony metanol, a następnie umieścić naczynie w zamrażarce w temperaturze -20°C dokładnie na 5 minut, bez wytrząsania. </li>
 <li>Usunąć metanol i przemyć trzykrotnie po 10 minut za pomocą 1X PBS. Odlać ostatni przemywany roztwór i zablokować tkankę za pomocą 0,2% Triton X-10 w 2% BSA/PBS przez 1 godzinę. Kroki przemywania i blokowania wykonuje się w temperaturze pokojowej. </li>
 <li>Inkubować mięśnie przez noc, z wytrząsaniem, w temperaturze 4°C w koktajlu przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w roztworze blokującym (patrz tabela). </li>
</ol>
4. Potrójne barwienie immunocytochemiczne złączy nerwowo-mięśniowych (NMJ) LAL: Dzień 2
<ol>
<li>Przemyć mięśnie w 1X PBS 3 razy, po 10 minut każde, w temperaturze pokojowej. </li>
<li>Dodać koktajl przeciwciał wtórnych w roztworze blokującym i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (por. tabela). Od tego momentu mięśnie muszą być chronione przed światłem, aby zapobiec fotoblaknięciu fluorescencji Alexa-Fluor 647.</li>
<li>Przemyć mięśnie w 1X PBS 3 razy, po 10 minut każde. </li>
<li>Usunąć pozostałą tkankę łączną w 1X PBS, odciąć krawędzie boczne mięśni LAL i zamocować na szkiełkach przedmiotowych stroną grzbietową do góry, używając szkiełek zakrywek i medium montującego. Użyć bezbarwnego lakieru do paznokci, aby przymocować zakrywkę. </li>
<li>Chronić szkiełka przed światłem i przechowywać w temperaturze -20°C do momentu analizy. </li>
</ol>
5. Obrazowanie konfokalne połączeń NMJ w LAL
<ol>
 <li>Obrazy konfokalne o wysokiej rozdzielczości pozyskano przy użyciu obiektywu olejowego Leica Plan Apo 63X (1.4NA) na mikroskopie konfokalnym Leica TCS 4D.</li>
 <li>Sygnały fluoresceiny oraz Alexa 647 skanowano jednocześnie, odpowiednio liniami laserowymi 48 nm (Argon, 48 nm, 20 mW) i 633 nm (HeNe, 63 nm, 10 mW). Następnie sekwencyjnie skanowano sygnał rodaminy linią laserową 561 nm (DPSS, 561, 20 mW). Przekroje optyczne zbierano w odstępach 0.3 μm, a liczba obrazów w płaszczyźnie z wynosiła od 60 do 80. Apertura diaphragm (pinhole) została ustawiona na Airy 1 (107.97 um). Format obrazu 1024 x 1024 (X,Y) przy powiększeniu (zoom) 1 i prędkości 40Hz daje rozmiar obrazu 234.32 μm x 234.32 μm oraz rozmiar piksela 229.05 nm x 29.05 nm.</li>
 <li>Następnie użyto oprogramowania akwizycyjnego Leica TCS-NT do rekonstrukcji serii obrazów z w celu uzyskania maksymalnych projekcji intensywności.</li>
 <li>Jasność i kontrast obrazów wielopanelowych dostosowano w programie Adobe Photoshop.</li>
 <li>W przypadku typowego mięśnia LAL powinno być możliwe przeanalizowanie około 75-10 połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ) en face. Stabilność synaptyczną określa się na podstawie takich cech jak przestrzenne dopasowanie elementów presynaptycznych, perysynaptycznych i postsynaptycznych (tj. nerwu, komórek Schwanna i mięśnia) oraz pomiarów powierzchni synaptycznej (tj. wielkości synapsy).</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki: 
W dorosłym ssaczym NMJ pojedynczy akson ruchowy tworzy drobne rozgałęzienia, które formują wysoce zróżnicowane drzewa zakończeń nerwowych (Ryc. 2; zielone) na pojedynczym włóknie mięśniowym, precyzyjnie przylegając do postsynaptycznych skupisk nikotynowych AChR (Ryc. 2; czerwone). W obszarze perysynaptycznym terminalne komórki Schwanna ściśle pokrywają wszystkie gałęzie presynaptycznych zakończeń nerwowych (Ryc. 2; niebieskie). Integralność strukturalna i funkcjonalna tej trójdzielnej organizacji zostaje poważnie zaburzona przez codzienne stosowanie inhibitorów mAChR specyficznych dla danego podtypu. W przedstawionym tutaj przykładzie (Ryc. 3) 4-DAMP, antagonista mAChR o wysokim powinowactwie do podtypów M1, M3, M4 i M5 mAChR, wywołuje selektywną eliminację zakończeń nerwowych z licznych NMJ na całej powierzchni mięśnia (Ryc. 3B, C). Ponadto terminalne komórki Schwanna wykazują nieprawidłową spoczynkowość8, co potwierdza jasne znakowanie S10 bez wydłużenia wypustek (Ryc. 3B", 3C"). Postsynaptycznie włókna mięśniowe pozostają prawidłowe i nie stwierdzono utraty nAChR (Ryc. 3B', 3C'). 
<img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig1.jpg" alt="Schemat nacięcia mięśnia LAL; ustawienie igły dla precyzyjnych cięć grzbietowo-brzusznych; metoda chirurgiczna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rysunek 1. Lokalizacja anatomiczna i organizacja mięśnia LAL. Przedstawiono lokalizację części rostralnej (rLAL), caudalnej (cLAL) oraz nerwu LAL (LALn) i odpowiadających im pasm blaszek końcowych (A, wstawka). Przedstawiono lokalizację i orientację igły względem mięśnia LAL dla procedury iniekcji (B). Przedstawiono miejsca nacięć dla procedury sekcji (C). 
<img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig2.jpg" alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna złączy nerwowo-mięśniowych z obrazowaniem NF/SV2, AChR oraz białka S10, obraz złożony." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rysunek 2. Trójdzielna organizacja złącza neuromięśniowego (NMJ). Widoki konfokalne z dużym powiększeniem NMJ myszy. Pojedynczy akson tworzy drobne gałązki końcowe (A), ściśle pokryte przez terminalne komórki Schwanna i ich wypustki (A', gwiazdki wskazują ciała terminalnych komórek Schwanna). Po stronie postsynaptycznej, w włóknie mięśniowym, skupisko nikotynowych receptorów AChR znajduje się w precyzyjnym sąsiedztwie gałęzi zakończeń nerwowych i terminalnych komórek Schwanna.
<img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig3.jpg" alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna; barwienie NF/SV2, AChR, S10; złącza nerwowo-mięśniowe; analiza porównawcza." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Mięśnie LAL traktowane 4-DAMP, antagonistą mAChR. Obrazy konfokalne mięśni LAL traktowanych wehikułem lub 4-DAMP w małym i dużym powiększeniu. W przeciwieństwie do mięśnia traktowanego wehikułem (A-A'''), liczne NMJ w mięśniu traktowanym 4-DAMP nie wykazują obecności zakończeń nerwowych (B-B''', C-C'''). Obszar zaznaczony ramką na Ryc. 2B został powiększony na Ryc. 2C.

<ol><li>Wright, M. C., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor+is+not+required+for+terminal+sprouting+and+compensatory+reinnervation+of+neuromuscular+synapses%3A+re-evaluation+of+CNTF+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice.</a> Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).</li>
<li>Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+motor+neuron+sprouting+in+vivo+by+ciliary+neurotrophic+factor+and+basic+fibroblast+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor.</a> J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).</li>
<li>Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+neuronal+determinants+locally+regulate+extrasynaptic+and+synaptic+growth+at+the+adult+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).</li>
<li>Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+factors+regulate+AChR+subunit+mRNAs+at+rat+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses.</a> J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).</li>
<li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse%3A+a+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).</li>
<li>Lanuza, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-+and+postsynaptic+maturation+of+the+neuromuscular+junction+during+neonatal+synapse+elimination+depends+on+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase.</a> C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).</li>
<li>Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+effects+of+beta-amyloid25-35+peptide+aggregates+on+transmitter+release+in+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).</li>
<li>Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+patterns+of+motor+nerve+terminal+sprouting+induced+by+ciliary+neurotrophic+factor+vs.+botulinum+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin.</a> J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).</li>
<li>Wright, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtypes+contribute+to+stability+and+growth%2C+but+not+compensatory+plasticity%2C+of+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).</li>
<li>Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ATP+inhibits+chloride+channels+in+mature+mammalian+skeletal+muscle+by+activating+P2Y1+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors.</a> J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).</li>
<li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).</li>
<li>Dorje, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonist+binding+profiles+of+five+cloned+human+muscarinic+receptor+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).</li>
<li>Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Union+of+Pharmacology.+XVII.+Classification+of+muscarinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors.</a> Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Metoda przedstawiona w niniejszej pracy umożliwia badanie wcześniej nierozpoznanych ról sygnalizacji mAChR specyficznej dla podtypu w stabilności i utrzymaniu ssaczych złączy nerwowo-mięśniowych (NMJ). Metoda ta będzie również przydatna do testowania efektów czynników neurotroficznych i środków farmakologicznych. Na przykład nasze laboratorium odkryło, że czynnik neurotroficzny rzęsek (CNTF) wywołał kiełkowanie niemal wszystkich zakończeń nerwowych w mięśniu LAL u dorosłych myszy1. Wynik ten kontrastował z wcz...

<table><tbody><tr><td>ketamina</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC0409-2051-05</td><td>Dawka: 120mg/kg</td></tr><tr><td>ksylazyna</td><td>Lloyd, Inc.</td><td>LA33806</td><td>Dawka: 8mg/kg</td></tr><tr><td>atropina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0132</td><td>(&amp;gt;98% czystości); Dawka: 0.2mg/kg &amp;mdash; 20mg/kg</td></tr><tr><td>atropina</td><td>Voigt Global Distribution</td><td>AT105</td><td>Klasa farmaceutyczna</td></tr><tr><td>Metoktramina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M105</td><td>Dawka: 100 - 400M</td></tr><tr><td>4-DAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D142</td><td>Dawka: 2.5mg/kg</td></tr><tr><td>AFDX-116</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1105</td><td>250M</td></tr><tr><td>AFDX-384</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1345</td><td>50M - 500M</td></tr><tr><td>MT 7</td><td>Peptides International</td><td>PMT-4340-s</td><td>0.1M - 1M</td></tr><tr><td>1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td>Najpierw przygotować 10% roztwór, rozpuszczając 10g w 100mL zdejonizowanej wody destylowanej; przygotować roztwór 4% w 1X PBS, dostosowując pH do 7.4</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodowy</td><td>Virbac Animal Health</td><td>NDC-051311-050-01</td><td>Dawka: 390mg/kg</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>Part # 184</td><td>Postępować zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu; można stosować szalki hodowlane o różnych rozmiarach (30mm, 60mm, 100mm) w zależności od potrzeb</td></tr><tr><td>0.1M glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7126</td><td>Dodać 0.185g do 25mL 2% BSA/PBS</td></tr><tr><td>2% albuminy surowicy bydlęcej (2% BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059-100g</td><td>Rozpuścić 2g BSA w 100mL 1X PBS</td></tr><tr><td>0.2% Triton X100 w 2% BSA/PBS (bufor blokujący)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-100mL</td><td>Rozpuścić 0.2ml w 100mL 2% BSA/PBS</td></tr><tr><td>&amp;#945;-bungarotoksyna</td><td>Invitrogen</td><td>T1175</td><td>Stosować w stężeniu 1:200</td></tr><tr><td>SMI-312</td><td>Sternberger Monoclonals Inc.</td><td>SMI312</td><td>Stosować w stężeniu 1:1000</td></tr><tr><td>SV2</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>SV2-Supernatant</td><td>Stosować w stężeniu 1:10</td></tr><tr><td>S100</td><td>Dako</td><td>Z0311</td><td>Stosować w stężeniu 1:400</td></tr><tr><td>FITC- kozie przeciwciało anty-mysie IgG1</td><td>Roche Group</td><td>03117731001</td><td>Stosować w stężeniu 1:200, lecz w przypadku wysokiego tła spróbować 1:400</td></tr><tr><td>sprzężone z Alexa-Fluor 647 kozie przeciwciało anty-królicze</td><td>Invitrogen</td><td>A21244</td><td>Stosować w stężeniu 1:200</td></tr><tr><td>fluorescencyjne medium montażowe Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Nie jest to medium utwardzające; szkiełko przykrywowe należy zabezpieczyć bezbarwnym lakierem do paznokci.</td></tr><tr><td>Małe nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta do sekcji</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr></tbody></table>

podskórne podawanie antagonistów muskarynowych oraz potrójne barwienie immunocytochemiczne mięśnia dźwigacza małżowiny usznej u myszy

Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice

Mięśnie kończyn tylnych gryzoni, takie jak mięsień brzuchaty łydki i mięsień piszczelowy przedni, są często wykorzystywane w badaniach farmakologicznych in vivo nad sygnałami kluczowymi dla tworzenia i utrzymania połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ) u ssaków. Jednakże penetracja leku do tych mięśni po podaniu podskórnym lub domięśniowym jest często niepełna lub nierównomierna, przez co wiele NMJ może pozostać nienaruszonych. Choć podawanie systemowe za pomocą urządzeń takich jak minipompy może poprawić efekty czasowo-przestrzenne, inwazyjny charakter tego podejścia może wywołać utrudniające interpretację reakcje zapalne i/lub bezpośrednie uszkodzenie mięśni. Ponadto pełna analiza NMJ w mięśniu kończyny tylnej jest trudna, ponieważ wymaga czasochłonnego seryjnego cięcia i rozległego barwienia immunocytochemicznego.
Mysi mięsień LAL (levator auris longus) to cienki, płaski płat mięśniowy położony powierzchownie na grzbiecie szyi. Jest to mięsień szybkokurczliwy, którego funkcją jest poruszanie małżowiną uszną. Składa się z części rostralnej i kaudalnej, które biorą początek w linii środkowej czaszki i rozciągają się bocznie do części chrzęstnej każdej małżowiny. Mięsień jest zaopatrywany przez gałąź nerwu twarzowego, która biegnie w kierunku kaudalnym po opuszczeniu otworu stylomastoidalnego. My oraz inni badacze stwierdziliśmy, że LAL jest wygodnym preparatem, który oferuje zalety w badaniu zarówno krótkoterminowych, jak i długoterminowych efektów działania leków na połączenia nerwowo-mięśniowe (NMJ) i mięśnie in vivo. Po pierwsze, jego powierzchowne położenie ułatwia wielokrotne miejscowe podawanie leków w lekkiej anestezji. Po drugie, jego cienkość (2-3 warstwy włókien mięśniowych) umożliwia wizualizację i analizę niemal wszystkich NMJ w obrębie mięśnia. Po trzecie, łatwość wypreparowania go wraz z nienaruszonym nerwem, w połączeniu ze wzorcem jego unerwienia, pozwala na dodatkową analizę elektrofizjologiczną in vitro9,5. Wreszcie, i być może najważniejsze, niewielka objętość podanego preparatu (˜50μl) łatwo pokrywa całą powierzchnię mięśnia, zapewnia równomierną i przedłużoną ekspozycję wszystkich jego NMJ na lek i eliminuje konieczność stosowania metod systemowych1,8.

Opisujemy procedury powtarzalnego podawania inhibitorów sygnalizacji muskarynowej do mięśnia dźwigacza małżowiny usznej (LAL) u młodych dorosłych myszy oraz późniejszego barwienia immunocytochemicznego jego złącz neuromięśniowych (NMJs) w preparatach całych organów. Mięsień LAL posiada wyjątkowe zalety w kontekście ujawniania farmakologicznych efektów in vivo w złączach NMJs.

Podskórne podawanie antagonistów muskarynowych oraz potrójne barwienie immunocytochemiczne mięśnia dźwigacza małżowiny usznej u myszy

Mięśnie kończyn tylnych gryzoni, takie jak mięsień brzuchaty łydki i mięsień piszczelowy przedni, są często wykorzystywane w badaniach farmakologicznych in vivo nad sygnałami...

Ogólnym celem tej procedury jest podanie antagonistów muskarynowych do mięśni LAL dorosłych myszy i zbadanie zmian morfologicznych złączy nerwowo-mięśniowych w odpowiedzi na inhibicję muskarynowych receptorów acetylocholiny. W pierwszej kolejności antagoniści muskarynowi są podawani podskórnie z pożądaną częstotliwością i przez określony czas. Po eutanazji traktowane mięśnie LAL są ostrożnie wypreparowywane, a wszelka tkanka łączna jest usuwana.Następnie tkankę mięśniową poddaje się potrójnemu znakowaniu immunologicznemu w celu wizualizacji komórek Schwanna nerwu ruchowego oraz nikotynowych receptorów acetylocholiny, stosując standardowe metody immunohistochemiczne. Na koniec wykorzystuje się mikroskopię konfokalną do zbadania zmian morfologicznych w obrębie połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ) w mięśniach traktowanych antagonistami muskarynowymi. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące, że organizacja morfologiczna trójdzielnego NMJ jest poważnie zaburzona w wyniku inhibicji muskarynowych receptorów acetylocholiny.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak podawanie związków farmaceutycznych do mięśni szkieletowych kończyny tylnej gryzonia, na przykład do mięśnia brzuchatego i mięśnia piszczelowego przedniego, jest fakt, że mięsień LAL jest bardziej dostępny i stosunkowo cienki. Pozwala to na wielokrotne miejscowe podawanie leków oraz wizualizację niemal wszystkich njs w obrębie mięśnia. Na blacie laboratoryjnym oczyszczonym etanolem, rozpuścić odpowiednią dawkę antagonisty muskarynowych receptorów acetylcholiny w sterylnym roztworze soli fizjologicznej w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. Pobrać 50 µl roztworu do strzykawki insulinowej o pojemności 1 cc, używając osobnej strzykawki dla każdej myszy.Należy również przygotować strzykawki zawierające wyłącznie sól fizjologiczną dla każdej myszy z grupy kontrolnej, utrzymując wszystkie strzykawki w lodzie do momentu wstrzyknięcia. Następnie znieczulone myszy należy poddać anestezji przy użyciu koktajlu ketaminy i ksylazyny. Po odpowiedniej sedacji potwierdzić znieczulenie za pomocą techniki ucisku palca, ogolić włosy pokrywające obszar rostralny głowy aż do obszaru karku, a pozostałe włosy przetrzeć 70% etanolem. Umieścić mysz pod stereomikroskopem i wprowadzić igłę strzykawki równolegle do mięśnia LAL w taki sposób, aby końcówka obejmowała aspekt kodalny.Lekko pociągnij za igłę strzykawki, aby upewnić się, że znajduje się ona w tkance łącznej i nie uszkadza bezpośrednio samego mięśnia LAL. Bardzo powoli rozpocznij wstrzykiwanie roztworu nad prawym mięśniem LAL, wycofując strzykawkę w czasie około jednej minuty. Przy prawidłowym wstrzyknięciu roztwór powinien utworzyć w skórze nad mięśniem kopułkę, która utrzyma się przez co najmniej jedną godzinę.Powtarzaj procedurę co 12 godzin przez okres od jednego do siedmiu dni przed sekcją mięśni; przeprowadź eutanazję, a następnie przypnij mysz w naczyniu sekcyjnym grzbietem do góry. Wykonaj pierwsze nacięcie tylko przez skórę, używając małych nożyczek sprężynowych, przecinając wzdłuż lewego LAL od obszaru tuż przed uchem do regionu wokół lewej łopatki. Ostrożnie usuń skórę w tym obszarze, unikając jednak cięcia zbyt blisko prawego ucha, ponieważ jest to jeden z punktów przyczepu dla prawego mięśnia LAL.Za pomocą małych nożyczek sprężynowych zlokalizuj pas tkanki tłuszczowej znajdujący się centralnie na powierzchni głowy, w miejscu styku prawego i lewego mięśnia LAL. Wykonaj cięcie jeden centymetr na prawo od tkanki tłuszczowej, w kierunku lewego ucha, od krawędzi proksymalnej lewego mięśnia LAL aż do barku. Po wykonaniu nacięcia odsunij prawy mięsień LAL za pomocą małej pęsety, aby odsłonić jego stronę brzuszną.Odetnij tkankę łączną i powięź, ostrożnie odciągając pęsetą mięsień LAL po prawej stronie. Wykonaj cięcie wokół końca kodlowego prawego mięśnia LAL u podstawy ucha, kierując się w stronę końca rostralnego prawego ucha. Prawy mięsień LAL pozostaw odchylony.Na tym etapie lepiej dołączyć więcej tkanki, niż ryzykować uszkodzenie samego LAL. Jeśli mięsień zacznie wysychać, pipetą nanieś 1 XPBS na mięsień.Umieść wypreparowany prawy LAL w 30 milimetrowym naczyniu hodowlanym typu „cigar dish” zawierającym 1xPBS, stroną grzbietową do góry. Przypnij cztery narożniki mięśnia za pomocą małych szpilek entomologicznych, używając do tego małej pęsety i nożyczek sprężynowych. Usuń tkankę łączną z powierzchni grzbietowej mięśnia prawego LAL.Odwróć mięsień i przypnij go ponownie, aby oczyścić powierzchnię brzuszną. Po nocnej inkubacji z przeciwciałem pierwotnym dwie lub trzy mięśnie można umieścić w jednej 30 milimetrowej próbce do potrójnego barwienia immunochemicznego.Przemyj mięśnie w roztworze 1x PBS 3 razy po 10 minut, a następnie dodaj koktajl przeciwciał wtórnych w roztworze blokującym na jedną godzinę. Inkubuj mięśnie w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem, aby zapobiec fotoblaknięciu; po godzinnej inkubacji przemyj mięśnie w roztworze 1x PBS 3 razy po 10 minut każde płukanie. Pozostawiając mięśnie przykryte świeżym roztworem 1x PBS po ostatnim przemyciu, usuń pod stereomikroskopem pozostałą tkankę łączną, a następnie odetnij krawędzie boczne LAL.Umieść tkankę mięśniową na szkiełku przedmiotowym stroną grzbietową do góry. Następnie dodaj dwie lub trzy krople medium montażowego. Nałóż szkiełka nakrywki i zabezpiecz je w miejscu za pomocą bezbarwnego lakieru do paznokci.Chronić preparaty przed światłem i przechowywać w temperaturze -20°C do czasu przeprowadzenia analizy. Widoki konfokalne przy dużym powiększeniu potrójnego immunobarwienia złącza neuromięśniowego (NMJ) myszy ukazują jego trójdzielną organizację. Cienkie gałęzie końcowe odchodzące z pojedynczego aksonu, zabarwione NFS V2, są ściśle otoczone przez ciała komórek Schwanna i ich wypustki, co ujawnia zabarwienie S100 po stronie postsynaptycznej.W włóknie mięśniowym grupa nikotynowych receptorów acetylocholiny znajduje się dokładnie naprzeciwko odgałęzień zakończeń nerwowych i terminalnych komórek Schwanna. Mięsień LAL myszy traktowanej nośnikiem wykazuje obecność njs, których organizacja trójskładnikowa nie jest zaburzona i które posiadają typowe, silnie zróżnicowane drzewa zakończeń nerwowych, co wykazano w potrójnym barwieniu immunologicznym. W przeciwieństwie do tego, integralność strukturalna i funkcjonalna tej organizacji trójskładnikowej jest poważnie zaburzona przez codzienne podawanie four damp.Podtypowa specyficzna substancja hamująca receptor muskarynowy acetylocholiny. W tym przypadku czwarta dawka wywołuje selektywną eliminację zakończeń nerwowych z wielu połączeń nerwowo-mięśniowych (njs) na całej powierzchni mięśnia. Dodatkowo, terminalne komórki Schwanna wykazują nienaturalną spoczynkowość, co potwierdza silne znakowanie białkiem S 100 bez wydłużenia wypustek.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiąść wiedzę na temat sposobu podawania antagonistów receptorów muskarynowych do mięśni LAL oraz potrójnego barwienia immunocytochemicznego tych mięśni w celu zbadania zmian morfologicznych złączy nerwowo-mięśniowych w odpowiedzi na inhibicję tych receptorów.

subcutaneous-administration-muscarinic-antagonists-triple

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Podskórne podawanie antagonistów muskarynowych i potrójne immunobarwienie mięśnia uniesionego ucha długiego u myszy

Wielokrotne pomiary fizjologii układu oddechowego gryzoni oraz pobieranie próbek komórek zapalnych dróg oddechowych są pożądane, lecz zazwyczaj niewykonalne. W niniejszym materiale opisujemy powtarzalną metodę intubacji doustnej myszy, która umożliwia wielokrotne pomiary nadreaktywności dróg oddechowych oraz pobieranie próbek komórek zapalnych dróg oddechowych.

Odwracalna, nieinwazyjna metoda pomiaru oporu dróg oddechowych i pobierania płynu z płukania pęcherzykowo-oskrzelowego u myszy

Opracowaliśmy prostą, niezawodną i stosunkowo tanią metodę intubacji dotchawiczej u myszy za pomocą bezpośredniej laryngoskopii przy użyciu otoskopu z wziernikiem 2,0 mm. Technika ta jest atraumatyczna i może być stosowana do powtarzania pomiarów w przewlekłych eksperymentach. Uważamy, że jest lepsza od tracheostomii lub wcześniej opisanych technik niechirurgicznych.

Intubacja dotchawicza u myszy za pomocą laryngoskopii bezpośredniej przy użyciu otoskopu

Ten obecny protokół wykorzystuje fluorescencyjne reportery, znakowanie in vivo i techniki obrazowania przyżyciowego, aby umożliwić monitorowanie dynamicznego procesu pobudzania neutrofili u żywych zwierząt.

Przyżyciowe obrazowanie torowania neutrofili przy użyciu myszy reporterowych DsRed napędzanych promotorem IL-1β

Opisano tutaj i porównano dwa podejścia mikrochirurgiczne do miejscowego dostarczania leków do ucha wewnętrznego pod względem wpływu na parametry słuchu, cytoarchitekturę ślimaka i ekspresję markerów stanu zapalnego.

Badanie porównawcze metod dostarczania leków ukierunkowanych do ucha wewnętrznego myszy: pęcherzyk a wstrzyknięcie przezbębenkowe

Tutaj prezentujemy protokół wywoływania paraliżu i zapalenia wzrokowo-rdzeniowego poprzez transfer limfocytów T specyficznych dla akwaporyny-4 (AQP4) z myszy AQP4-/- do myszy WT. Ponadto pokazujemy, jak wykorzystać seryjną optyczną tomografię koherentną do monitorowania dysfunkcji układu wzrokowego.

Indukcja paraliżu i uszkodzenia układu wzrokowego u myszy przez limfocyty T specyficzne dla Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Protokół opisany w tym artykule wykorzystuje mięsień levator auris longus (LAL) myszy do rejestrowania spontanicznych i wywołanych przez nerwy potencjałów postsynaptycznych (zacisk prądowy) i prądów (zacisk napięcia) w złączu nerwowo-mięśniowym. Zastosowanie tej techniki może dostarczyć kluczowych informacji na temat mechanizmów transmisji synaptycznej w warunkach normalnych i chorobowych.

Dźwigacz Auris Longus Przygotowanie do badania przewodnictwa nerwowo-mięśniowego ssaków w warunkach cęgowania napięciowego

Przedstawiamy szczegółowe podejście do pobierania śliny, w tym mysią tracheostomię i izolację trzech głównych gruczołów ślinowych.

Ocena funkcjonalna śliny myszy za pomocą stymulacji pilokarpiną po frakcjonowanym promieniowaniu

Tutaj pokazujemy, jak wykonać mikroskopię przyżyciową na żyłkach powłosilarnych mięśnia cremaster myszy. Powszechnie stosowany do różnych modeli zapalenia i sepsy, szczególnie tych indukowanych przez chemokiny i cytokiny, podkreślamy jego znaczenie w badaniu muskolopatii obejmujących przesadny naciek leukocytów mięśniowych.

Naciek leukocytów mięśnia Cremaster u myszy oceniany za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Zapalenie powierzchni oka uszkadza tkanki powierzchni oka i zagraża funkcjom życiowym oka. Niniejszy protokół opisuje metodę wywoływania zapalenia oka i zbierania uszkodzonych tkanek w mysim modelu dysfunkcji gruczołów Meiboma (MGD).

Indukcja stanu zapalnego powierzchni oka i gromadzenie zajętych tkanek

Tutaj prezentujemy protokół, który łączy elektroporację in vivo i denerwację mięśnia dźwigacza długiego czaszki (LAL). Zabieg ten umożliwia badanie potencjalnej roli białek pochodzenia mięśniowego w regeneracji synapsy nerwowo-mięśniowej.

Połączona elektroporacja in vivo i krótkotrwałe unerwienie mięśnia szkieletowego dźwigacza bocznego zorza długiego czaszki

Poznaj metodę podawania antagonistów muskaryny podskórnie w mięsień dźwigacz aury długiej u myszy oraz potrójne barwienie immunologiczne. Technika ta umożliwia badanie zmian morfologicznych złączy nerwowo-mięśniowych.

Podskórne podawanie antagonistów muskarynowych oraz potrójne barwienie immunocytochemiczne mięśnia dźwigacza małżowiny usznej u myszy

Przeglądaj więcej filmów