Izolacja białek powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych z hodowli astrocytów

Weź kulturę astrocytów i usuń pożywkę. Dodaj bufor fizjologiczny i inkubuj na lodzie, hamując endocytozę białek powierzchniowych komórek.

Inkubować z odczynnikiem biotynylacyjnym, który wiąże białka na powierzchni komórki.

Następnie inkubować z buforem hartującym, aby dezaktywować nieprzereagowany odczynnik.

Dodaj zimny bufor fizjologiczny i mechanicznie odłącz komórki. Przenieś komórki, a następnie odwiruj i wyrzuć supernatant.

Inkubować z buforem do lizy w celu lizy komórek, uwalniając biotynylowane białka wewnątrzkomórkowe na powierzchni komórek i niebiotynylowane.

Odwirować, zebrać supernatant i oddzielić frakcję o całkowitej zawartości białka.

Pozostałą frakcję inkubować pod wpływem mieszania z kulkami pokrytymi streptawidyną, które wiążą biotynylowane białka.

Zakręć kulki związane z białkami na powierzchni komórki i oddziel supernatant zawierający białka wewnątrzkomórkowe.

Umyj kulki pod mieszaniem w celu usunięcia niespecyficznie związanych białek, a następnie odwiruj i wyrzuć supernatant, izolując białka na powierzchni komórki.

Frakcje zawierające białka całkowite, wewnątrzkomórkowe i powierzchniowe komórki są gotowe do analizy.

Aby rozpocząć tę procedurę, usuń kultury astr