$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Zacznij od naczynia zawierającego matrycę krzemową, która ma wiele małych kanałów podłączonych do portów wlotowych i wylotowych.
Wstrzyknąć badane białko o działaniu odpychającym, przez wlot w celu wypełnienia kanałów.
Inkubować, aby umożliwić przyleganie białka w obszarze kanału, tworząc strefy białka testowego, a następnie przemyć.
Usunąć matrycę, pokryć pokryty obszar białkiem kontrolnym o atrakcyjnej aktywności i inkubować.
Ułatwia to przyleganie białka kontrolnego do pustych obszarów między strefami białka testowego, tworząc strefy białka kontrolnego z naprzemiennym wzorem w paski, a następnie mycie.
Dodaj lamininę, aby pokryć obszar w paski, a następnie umyj.
Zasiej pokryty obszar jednokomórkową zawiesiną neuronów hipokampa i inkubuj.
W strefie białka testowego neurony oddziałują z białkami, wyzwalając sygnały, które powodują odpychanie neuronów, hamując ich przyczepienie.
W przeciwieństwie do tego, interakcje neuron-białko w strefie białka kontrolnego promują przyczepienie neuronów, wspierając ich wzrost i wydłużenie aksonów.
Przygotować znakowane fluorescencyjnie białka rekombinowane w PBS. Zrób 25 mikrolitrów na każde naczynie w paski. Pozostaw mieszaninę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie do każdej potrawy załaduj strzykawkę o rozmiarze 22 z 25 mikrolitrami rozcieńczonego białka i wstrzyknij ją przez mały otwór z boku matrycy.
Unikaj wstrzykiwania pęcherzyków powietrza do matryc, ponieważ zakłócą one wiązanie białek z chorobą.
Teraz inkubuj naczynia przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po inkubacji umieścić 300 mikrolitrów PBS w górnej szczelinie każdej matrycy. Następnie odessaj PBS z małego otworu znajdującego się z boku każdej matrycy, aby usunąć wszystkie nieprzyłączone rekombinowane białka. Nie należy w pełni zasysać PBS, ponieważ białka wyschną.
Wykonaj to płukanie PBS w sumie trzy razy. Następnie ostrożnie wyjmij matrycę z każdego naczynia. Następnie natychmiast dodaj około 100 mikrolitrów białka kontrolnego na całym obszarze w paski, tworząc naprzemienną powłokę na każdym naczyniu.
Następnie inkubuj naczynia przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Tymczasem na lodzie rozmrozić lamininę w PBS w ilości 20 mikrogramów na mililitr. Po 30 minutach umyj naczynia trzykrotnie PBS. Następnie posmaruj każde naczynie około 100 mikrolitrami zimnej lamininy i włóż naczynia do inkubatora na kolejną godzinę.
Godzinę później użyj PBS, aby ponownie umyć naczynia trzy razy. Po trzecim myciu dodaj około 150 mikrolitrów pożywki hodowlanej do każdego naczynia. Następnie inkubuj naczynia w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne. Policz komórki za pomocą hemocytometru i zagraj 10 000 neuronów w 150 mikrolitrach pożywki hodowlanej na każdej przygotowanej płytce w paski. Ostrożnie odłożyć zawiesinę, aby pokryła cały obszar pasków.