Izolacja włókien amyloidowych z ekstraktu z tkanki mózgowej

Weźmy ekstrakt z tkanki mózgowej myszy zawierający białka nieamyloidowe i fibryle amyloidowe, nierozpuszczalny agregat białkowy.

Dodaj stałą sacharozę i wymieszaj, zwiększając gęstość roztworu.

Przenieś go i odwiruj, aby oddzielić gęstsze białka od zanieczyszczeń.

Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w buforze o wyższym stężeniu sacharozy, wymieszać i odwirować.

Zbierz górną warstwę zawierającą kilka włókienek amyloidu w świeżej probówce, dodaj bufor do płukania i wymieszaj.

Teraz odrzuć środkową warstwę i przenieś osad wzbogacony w fibryle amyloidowe do probówki zawierającej frakcję górnej warstwy, aby uzyskać maksymalną izolację.

Odwirować połączone frakcje i odrzucić supernatant. Dodaj bufor trawienny i inkubuj w celu degradacji wyłącznie białek nieamyloidowych.

Odwirować i usunąć supernatant. Umyj osad, aby usunąć resztki strawionych białek.

Zawiesić osad w buforze do solubilizacji na bazie sacharozy zawierającym detergent, który rozpuszcza pozostałe białka nieamyloidowe.

Odwirować, usunąć supernatant i ponownie zawiesić wyizolowane włókienka amyloidowe.

Zacznij od umieszczenia świeżo wypreparowanego lub zamrożonego obszaru tkanki mózgowej w dwumililitrowej probówce zawierającej od sześciu do ośmiu kulek ceramicznych i świeżo przygotowanego lodowatego buforu homogenizacyjnego. Następnie zmiel tkankę za pomocą homogenizatora z młynkiem perełkowym z prędkością 4,000 obr./min, z dwoma cyklami po 30 sekund włączania i wyłączania impulsu. Teraz dodaj dziewięć mililitrów lodowatego buforu homogenizacyjnego do jednego mililitra homogenatu tkanki mózgowej w 15-mililitrowej probówce i uszczelnij paskami folii woskowej laboratoryjnej.

Aby zapewnić solidną rozpuszczalność, utrzymuj rurkę obracającą się przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnego dnia dodać stałą sacharozę do zawiesiny ekstraktu tkankowego do końcowego stężenia 1,2 mola. Dobrze wymieszaj i odwiruj 250 000 razy g przez 45 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach buforu homogenizacyjnego zawierającego 1,9 molowej sacharozy przez rozcieranie i odwirować pod ciśnieniem 125 000 razy g przez 45 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Po odwirowaniu przenieś górną białą warstwę ciała stałego do świeżej probówki i rozpuścić w 1 mililitrze lodowatego buforu do mycia, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół. Ponieważ osad jest również wzbogacony w włókienka amyloidowe, odrzuć środkową warstwę wody i połącz osad z warstwą górną, aby uzyskać wyższą wydajność. Odwirować połączone frakcje 8 000 razy g przez 20 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w 1 mililitrze lodowatego buforu do wytrawiania i inkubować w temperaturze pokojowej przez trzy godziny na wirze. Ponownie odwirować próbkę, a następnie dwukrotnie przemyć osad w 1 mililitrze lodowatego buforu Tris i ponownie odwirować. Po drugim płukaniu ponownie zawieś osad w 1 mililitrze buforu do solubilizacji, pipetując w górę iw dół, a następnie szybko odwiruj probówkę pod ciśnieniem 200 000 razy g przez 60 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Zachowaj osad, a następnie zmniejsz stężenie sacharozy z 1,3 do 1 mola, dodając 50 milimolowy bufor Tris do supernatantu. Ponownie odwirować supernatant, a następnie rozpuścić oba granulki w 100 mikrolitrach buforu Tris zawierającego 0,5% SDS. W celu oczyszczenia amyloidu należy rozpuścić granulki bogate w amyloid za pomocą fal ultradźwiękowych w urządzeniu do sonikacji kąpieli przez 20 cykli. Następnie natychmiast odwiruj materiał w temperaturze 20 000 razy g przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach 0,5% buforu SDS Tris i powtórzyć mycie jeszcze cztery razy. Po ostatnim etapie wirowania umyj granulat w 200 mikrolitrach ultraczystej wody i odwiruj 20 000 razy g przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby usunąć pozostały detergent. Rozpuść końcową osadkę zawierającą oczyszczone włókna amyloidowe w 100 mikrolitrach ultraczystej wody.