JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:55 min. • July 8th, 2025
Zacznij od probówki zawierającej wstępnie obrobione kulki magnetyczne pokryte przeciwciałami specyficznymi dla docelowego białka usieciowanego z DNA.
Dodać lizat neuronu ruchowego zawierający fragmenty DNA i inkubować z mieszaniem.
Fragmenty DNA oddziałują z kulkami pokrytymi przeciwciałami, tworząc kompleksy koraliko-DNA.
Odwirować, aby zebrać ciecz z nasadki i umieścić ją na separatorze magnetycznym w celu wytrącenia kompleksów perełka-DNA.
Usunąć supernatant zawierający niezwiązane fragmenty DNA.
Wprowadź bufor do lizy na bazie detergentu, aby rozpuścić niespecyficznie związane fragmenty DNA.
Odwirować i przeprowadzić separację magnetyczną, a następnie usunąć supernatant.
Umyj buforem o wysokiej zawartości soli, aby zakłócić niespecyficzne interakcje. Odwirować, przeprowadzić separację magnetyczną i usunąć supernatant.
Przemyć buforem LiCl, aby usunąć pozostałe niespecyficzne interakcje. Odwirować, przeprowadzić separację magnetyczną i usunąć supernatant.
Na koniec przemyć buforem Tris-HCl, odwirować i przeprowadzić separację magnetyczną.
Usunąć supernatant i zebrać kulki zawierające docelowe kompleksy białko-DNA.
Aby rozpocząć immunoprecypitację chromatyny, umyj kulki pokryte przeciwciałem w 1 mililitrze roztworu blokującego. Umieść probówkę zawierającą kulki pokryte przeciwciałem na platformie kołyszącej w temperaturze 4 stopni Celsjusza na 5 minut. Po krótkim odwirowaniu umieść probówkę na stojaku magnetycznym i usuń supernatant.
Zawiesić kulki pokryte przeciwciałem w 50 mikrolitrach roztworu blokującego. Dodaj 1 mililitr sonikowanych lizatów do kulek pokrytych przeciwciałami. Następnie inkubuj próbkę na platformie kołyszącej się w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc. Po pozostawieniu próbki do inkubacji przez noc, zebrać płyn z nakrętki, krótko obracając probówkę. Następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym i po 1 minucie ostrożnie usuń supernatant za pomocą pipety.
Następnie wykonaj serię prań w następujący sposób. Dodać do próbki 1 mililitr buforu do płukania na zimno zawierającego CPI. Mieszać próbkę na platformie kołyszącej w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 5 minut. Krótko obrócić probówkę z próbką. Następnie umieść na stojaku magnetycznym. Po 1 minucie usunąć supernatant za pomocą pipety.