Opracowanie modelu in vitro zakażenia wirusem Zika w organoidach mózgowych

Weź płytkę wielodołkową zawierającą ludzkie organoidy mózgowe w pożywce do indukcji neuronalnej.

Organoidy zawierają komórki macierzyste, promieniste komórki glejowe, neuronalne komórki progenitorowe lub NPC oraz neurony ułożone w promienisty wzór zwany rozetą, naśladujący rozwijający się mózg.

Usunąć pożywkę i umyć organoidy buforem.

Wirusa Zika zawieszonego w buforze dodać do studzienek testowych i tylko bufor do studzienek kontrolnych.

Inkubuj, pozwalając wirusowi związać się ze swoimi receptorami na NPC i zostać zinternalizowanym.

Umyj w celu usunięcia niezinternalizowanych wirusów, a następnie dodaj świeżą pożywkę do indukcji neuronów i inkubuj.

Zinternalizowane wirusy wykorzystują maszynerię komórek gospodarza do tworzenia nowych cząsteczek wirusa.

Namnażanie się wirusa wywołuje komórkową reakcję stresową, która indukuje apoptozę, zmniejszając liczbę NPC dostępnych do rozwoju organoidów.

Z biegiem czasu zakażone organoidy wykazują zmniejszony rozmiar i zaburzoną morfologię, co odzwierciedla nieprawidłowy rozwój mózgu u ludzi zakażonych wirusem Zika.

Doprowadź 1X Zrównoważony Roztwór Soli Earle'a, 1X PBS i pożywkę do indukcji neuronalnej do 37 stopni Celsjusza w gorącej kąpieli wodnej. Następnie rozcieńczyć wirusa Zika o znanym stężeniu w roztworze 1X Earle'a, aby uzyskać docelową wielokrotność infekcji, która zwykle wynosi od 0,1 do 10. Za pomocą pipety P200 ostrożnie usuń całe podłoże z każdego organoidu, a następnie szybko umyj organoidy 200 mikrolitrami ciepłego 1X PBS.

Podczas wyjmowania pożywki z każdej studzienki bardzo ważne jest, aby nie dotykać organoidu ani nie zasysać go do pipety. Może to spowodować nieodwracalne uszkodzenie organoidu. W takim przypadku najlepiej wyrzucić organoid.

Następnie ostrożnie usuń cały pozostały płyn z każdej studzienki organoidowej za pomocą jednokanałowej pipety P200. Następnie szybko dodaj 50 mikrolitrów 1x roztworu Earle'a do udawanej infekcji lub roztworu wirusa Zika do każdej studzienki. Upewnij się, że każdy organoid jest całkowicie zanurzony. Po zakończeniu umieść płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie godziny.

Po zakończeniu ekspozycji na wirusa. Umyj każdą studzienkę organoidów 200 mikrolitrami PBS. Pozwól organoidom osiąść przez 15 sekund, a następnie usuń PBS za pomocą jednokanałowej pipety P200. Na koniec dodaj 200 mikrolitrów świeżej pożywki do indukcji neuronów do każdej studzienki i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze.