Ocena żywotności neuronów w hodowli neuronów móżdżku za pomocą podwójnego barwienia

Zacznij od płytki hodowlanej potraktowanej środkiem antymitotycznym, który hamuje wzrost komórek glejowych, pozostawiając głównie neurony ziarniste móżdżku i niewielką liczbę komórek glejowych.

Usuń pożywkę i powoli dodaj zimną sól fizjologiczną buforowaną fosforanami lub PBS, aby utrzymać żywotność komórek.

Zastąp bufor zimną mieszanką barwiącą i inkubuj.

Mieszanina ta zawiera dioctan fluoresceiny lub FDA, związek niefluorescencyjny, oraz jodek propidyny lub PI, nieprzepuszczalny dla błony barwnik fluorescencyjny.

FDA dyfunduje do komórek, gdzie funkcjonalna esterazy w żywych komórkach przekształca ją w zielony związek fluorescencyjny.

PI dostaje się do martwych komórek przez uszkodzone błony, wiąże się z DNA i emituje czerwoną fluorescencję.

Usuń roztwór barwiący i dodaj zimny PBS, aby zapobiec wysychaniu komórek.

Uzyskaj obrazy fluorescencyjne dla barwień FDA i PI oraz obraz z kontrastem fazowym. Scalanie obrazów FDA i PI.

Następnie porównaj ten obraz fluorescencyjny z obrazem kontrastu fazowego, który pomaga wykluczyć duże komórki glejowe.

Czerwona fluorescencja wskazuje na śmierć neuronów, podczas gdy zielona fluorescencja oznacza żywotność neuronów.

Barwienie należy rozpocząć od zmieszania dioctanu fluoresceiny do końcowego stężenia 10 mikrogramów na mililitr i jodku propidyny do końcowego stężenia 50 mikrogramów na mililitr w 10 mililitrach PBS. Wymieszaj roztwór FDA PI przez wirowanie i umieść na lodzie. Umieść płytkę hodowlaną na lodzie.

Ostrożnie zassać pożywkę hodowlaną, nie dotykając komórek końcówką pipety. Następnie powoli dodawaj zimny PBS. Odessać PBS, a następnie dodać zimny roztwór roboczy FDA PI lub FDA PI Hoechst. Połóż talerz na lodzie na pięć minut. Następnie, po zassaniu roztworu roboczego FDA PI lub FDA PI Hoechst, dodaj zimny PBS do każdej studzienki.

Upewnij się, że mikroskop fluorescencyjny jest prawidłowo ustawiony. Wykrywanie emisji fluorescencji dla FDA PI i Hoechst odpowiednio przy 520, 620 i 460 nanometrach, przy użyciu czasu ekspozycji od 100 do 300 milisekund i wzmocnienia analogowego 2,8X. Po zebraniu obrazów fluorescencyjnych zrób zdjęcie w normalnym świetle, korzystając z trybu kontrastu fazowego.

W przypadku podwójnego barwienia PI FDA nałóż obrazy komórek, przeciągając warstwę dodatnią FDA na warstwę dodatnią PI w oprogramowaniu do edycji grafiki. Dostosuj krycie warstwy dodatniej przez FDA, wprowadzając wartość 50% w polu krycia panelu Warstwy. Scal dwie warstwy, otwierając menu Warstwa i klikając przycisk Scal widoczne. Ustaw kontrast nałożonych obrazów, wprowadzając 50 w polu kontrastu w obszarze Obraz, Korekty, Jasność/Kontrast. Sprawdź, czy na obrazach nakładki nie ma podwójnie dodatnich komórek FDA i PI.

W przypadku potrójnego barwienia FDA PI Hoechst nałóż obrazy komórek, ponownie przeciągając warstwę dodatnią FDA na warstwę dodatnią PI, dostosowując nieprzezroczystość warstwy dodatniej FDA i scalając obrazy jak poprzednio. Następnie przeciągnij warstwę Hoechst-positive na scaloną warstwę.

Dostosuj krycie warstwy Hoechst-positive, wprowadzając 50% w polu krycia panelu Warstwy, a następnie połącz dwie warstwy, otwierając menu Warstwa i klikając przycisk Scal widoczne. Wizualnie odróżnij duże, nieregularne komórki glejowe od ziarnistych neuronów móżdżku, porównując obrazy wykonane w trybie fluorescencyjnym z tymi wykonanymi w trybie kontrastu fazowego.