Ocena żywotności neuronów w hodowli neuronów móżdżku za pomocą podwójnego barwienia

Zacznij od płytki hodowlanej potraktowanej środkiem antymitotycznym, który hamuje wzrost komórek glejowych, pozostawiając głównie neurony ziarniste móżdżku i niewielką liczbę komórek glejowych.

Usuń pożywkę i powoli dodaj zimną sól fizjologiczną buforowaną fosforanami lub PBS, aby utrzymać żywotność komórek.

Zastąp bufor zimną mieszanką barwiącą i inkubuj.

Mieszanina ta zawiera dioctan fluoresceiny lub FDA, związek niefluorescencyjny, oraz jodek propidyny lub PI, nieprzepuszczalny dla błony barwnik fluorescencyjny.

FDA dyfunduje do komórek, gdzie funkcjonalna esterazy w żywych komórkach przekształca ją w zielony związek fluorescencyjny.

PI dostaje się do martwych komórek przez uszkodzone błony, wiąże się z DNA i emituje czerwoną fluorescencję.

Usuń roztwór barwiący i dodaj zimny PBS, aby zapobiec wysychaniu komórek.

Uzyskaj obrazy fluorescencyjne dla barwień FDA i PI oraz obraz z kontrastem fazowym. Scalanie obrazów FDA i PI.

Następnie porównaj ten obraz fluorescencyjny z obrazem kontrastu fazowego, który pomaga wykluczyć duże komórki glejowe.

Czerwona fluorescencja wskazuje na śmierć neuronów, podczas gdy zielona fluorescencja oznacza żywotność neuronów.

Barwienie należy rozpocząć