Wizualizacja neuronów ciała grzyba w mózgach Drosophila za pomocą barwienia immunologicznego

Umieść dzikie i zmutowane mózgi Drosophila w roztworze zawierającym utrwalacz i detergent. Inkubuj z delikatnym kołysaniem.

Utrwalacz zachowuje morfologię tkanki, podczas gdy detergent przenika przez błony komórkowe.

Pozwól mózgom się uspokoić, a następnie usuń roztwór.

Umyj chusteczki buforem.

Dodaj roztwór blokujący, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał.

Usuń roztwór i dodaj pierwszorzędowe przeciwciała skierowane przeciwko specyficznemu białku, które reguluje rozwój aksonów w neuronach grzyba w mózgu lub MB.

Inkubować w celu promowania wiązania przeciwciał.

Przemyć buforem w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał.

Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem skierowanymi na przeciwciała pierwszorzędowe.

Umyj ponownie, aby usunąć niezwiązane przeciwciała, a następnie ponownie zawieś mózgi w pożywce montażowej.

Zamontuj mózgi na szkiełku podstawowym i zwizualizuj je pod mikroskopem fluorescencyjnym.

W porównaniu z typem dzikim, zmutowane mózgi wykazują wadliwy fenotyp, z błędnymi projekcjami aksonów i brakującymi płatami MB.

Pod mikroskopem użyj pipety P200, aby przenieść od 10 do 15 wypreparowanych mózgów o tym samym genotypie do 0,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej wypełnionej 4% paraformaldehydem rozcieńczonym w PTN. Następnie inkubuj mózgi przez 20 minut, powoli kołysząc w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu pozwól mózgom osiąść na dnie rurki, a następnie usuń utrwalacz.

Następnie wykonaj dwa szybkie mycia z 500 mikrolitrami PTN na pranie. Wymień PTN, gdy tylko mózgi osiądą w probówce. Następnie wykonaj trzy długie prania z użyciem PTN, delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej.

Po tych płukaniach mózgi mogą być przechowywane przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza w PTN. Po usunięciu ostatniego płukania PTN, inkubować mózgi w 0,5 mililitra roztworu blokującego przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej i z delikatnym mieszaniem. Po usunięciu roztworu blokującego dodaj przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym i inkubuj mózgi w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez dwa dni z delikatnym mieszaniem.

Usuń przeciwciało pierwszorzędowe za pomocą 5-mytego pułku myjącego PTN, a następnie nałóż przeciwciała drugorzędowe. Pozwól tym przeciwciałom inkubować się z tkankami przez trzy godziny w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem za pomocą kołysania.

Po inkubacji mózgów w roztworze przeciwciał drugorzędowych, należy zastosować reżim myjący PTN, przykrywając próbki folią po każdym przemyciu, a na koniec usunąć jak najwięcej buforu. Następnie dodaj 75 mikrolitrów fluorescencyjnego podłoża mocującego zapobiegającego blaknięciu i przelej mózgi i pożywkę do i z końcówki pipety tylko raz. Rurkę można następnie zawinąć w folię i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez kilka dni, ale najlepiej przystąpić bezpośrednio do montażu.

Aby zamontować mózgi, zbuduj zjeżdżalnię mostową. Umieść dwa podstawowe szkiełka nakrywkowe w odległości około 1 centymetra od siebie na dodatnio naładowanym szkiełku. Upewnij się, że dodatnio naładowany suwak jest skierowany do góry. Następnie przyklej szkiełka nakrywkowe do szkiełka lakierem do paznokci i pozwól lakierowi całkowicie wyschnąć przed kontynuacją.

Następnie umieść szkiełko pod mikroskopem stereoskopowym i odpipetuj mózg i pożywkę w przestrzeń między szkiełkami nakrywkowymi. Pamiętaj, aby dostosować oświetlenie, aby poprawić wizualizację mózgu.

Następnie zassaj dodatkowy nośnik montażowy ze szkiełka, uważając, aby uniknąć mózgu. Następnie odchodować pozostały nadmiar nośnika montażowego. Pozwoli to na dokładniejsze ustawienie mózgów.

Teraz za pomocą kleszczy zorientuj mózgi we wzorze siatki z płatami czułkowymi skierowanymi do góry. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na mózgach i użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić krawędzie górnego szkiełka nakrywkowego, które są przymocowane do podstawowych szkiełek nakrywkowych. Teraz załaduj środkową wnękę świeżymi mediami montażowymi kroplami, umożliwiając wciągnięcie nośnika pod szkiełko nakrywkowe za pomocą kapilary. Gdy ubytek zostanie wypełniony, uszczelnij go całkowicie za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci