JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:28 min • July 8th, 2025
Weź znieczulone larwy danio pręgowanego do naczynia wyłożonego żelem agarozowym i upewnij się, że mózg jest skierowany do góry w celu wstrzyknięcia.
Umieść naczynie pod mikroskopem, aby uwidocznić komory mózgu, które są wypełnionymi płynem jamami w rozwijającym się mózgu.
Weź igłę do mikroiniekcji zawierającą roztwór lipopolisacharydów lub LPS, składnika bakteryjnego, aby wywołać odpowiedź immunologiczną.
Umieść igłę nad tektum mózgu, regionem zawierającym neurony i rezydujące komórki odpornościowe, w szczególności mikroglej.
Nakłuć mózg igłą i wstrzyknąć roztwór LPS do komory.
Mikroglej w otaczającej tkance wiąże się z LPS poprzez receptory toll-podobne.
Wiązanie wyzwala uwalnianie cytokin prozapalnych, które rekrutują neutrofile do tego miejsca, prowadząc do zapalenia nerwów.
Neutrofile generują wybuchy reaktywnych form tlenu i uwalniają enzymy proteolityczne, co powoduje śmierć neuronów.
Przenieś larwy wywołane zapaleniem nerwów do pożywki hodowlanej, aby utrzymać je do dalszych testów.
Ustawić mikromanipulator tak, aby końcówka igły aparatu do mikroiniekcji znajdowała się w tym samym polu widzenia, co larwy w dużym powiększeniu. Rozpuść roztwór 2% agarozy w podwójnie destylowanej wodzie za pomocą kuchenki mikrofalowej. Wlej stopioną agarozę do plastikowego naczynia. Użyj plastikowej pipety transferowej, aby przetransportować znieczulone larwy do środka plastikowego naczynia pokrytego 2% agarozą.
Ustaw zamontowane larwy stroną do mózgu do góry, aby uzyskać dostęp do igły. Dostosuj powiększenie mikroskopu tak, aby struktura komory mózgowej danio pręgowanego była wyraźnie widoczna w polu widzenia. Ostrożnie umieść igłę nad tektum mózgu. Oczyść obszar mózgu 70% etanolem i powoli nakłuj skórę mózgu danio pręgowanego końcówką igły za pomocą mikromanipulatora.
Naciśnij pedał nożny, aby wyrzucić jeden nanolitr 1X PBS lub różne stężenia lipopolisacharydu. Natychmiast po wstrzyknięciu przenieść larwy do czystego podłoża E3.