JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:51 min. • July 8th, 2025
Pobrać kultury mikrogleju na wielodołkowej płytce zawierającej pożywkę.
Zastąp połowę pożywki w studzience testowej pożywką zawierającą nanocząstki srebra, a w studzience kontrolnej pożywką nośnikową. Inkubować.
Mikroglej internalizuje nanocząsteczki, ulega aktywacji i uwalnia cytokiny prozapalne.
Przenieść pożywkę nośnika i kondycjonowane pożywki zawierające te cytokiny do filtrów zamontowanych na probówkach zbiorczych.
Wirować w celu usunięcia nanocząstek, zatrzymując cytokiny.
Odwróć filtry do nowych probówek zbiorczych, odwiruj i zbierz pożywkę. Dodaj świeże nośniki.
Następnie weź hodowle neuronów podwzgórza.
Zastąp połowę pożywki studzienki kontrolnej pożywką pojazdu, a pożywkę studzienki testowej pożywką kondycjonowaną. Inkubować.
Cytokiny wiążą się z receptorami na neuronach podwzgórza, aktywując szlaki sygnałowe, które indukują śmierć neuronów.
Dodaj rezazurynę i inkubuj.
W żywych komórkach enzymy dehydrogenazy redukują słabo fluorescencyjną rezyzynę do fluorescencyjnej rezorufy.
Zmierz fluorescencję.
Zmniejszona fluorescencja wskazuje na zwiększoną śmierć neuronów w podwzgórzu, co sugeruje neurotoksyczność wywołaną przez nanocząstki.
Na początek zbierz 200 mikrolitrów pożywki sklarowanej nad osadem z każdej płytki i załaduj ją do filtra, który usunie nanocząstki, umieszczonego nad probówką do mikrowirówki.
Należy pamiętać, że podczas filtrowania nanocząstek ich wielkość, kształt i stężenie będą miały wpływ na skuteczność filtracji, dlatego zaleca się wcześniejsze przetestowanie filtracji.
Teraz odwiruj probówki do 14 000 g w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie wyrzuć przepływ, który zawiera nanocząsteczki, i umieść filtry do góry nogami w nowych probówkach zbiorczych. Obracaj filtry do góry nogami z prędkością 1,000 g przez dwie minuty, aby zebrać skoncentrowaną, kondycjonowaną pożywkę zawierającą cytokiny.
Następnie zwiększ objętość kolekcji do 400 mikrolitrów ze świeżo przygotowanym uzupełnionym DMEM i przechowuj probówki na lodzie. Do tego testu należy ustalić komórki podwzgórza z zamrożonych zapasów, stosując te same metody, które opisano w przypadku tworzenia kultur mikrogleju. Ostatecznie użyj ich do wysiewu czarnościennych płytek z przezroczystym dnem z 5,000 komórek na dołek w 200 mikrolitrach uzupełnionego DMEM.
Po 24 godzinach hodowli należy usunąć 100 mikrolitrów pożywki i zastąpić ją 100 mikrolitrami przefiltrowanej i zagęszczonej pożywki pobranej z aktywowanych kultur komórek mikrogleju. Następnie inkubować płytkę przez 24 godziny w standardowych warunkach. Następnego dnia dodaj 22 mikrolitry odczynnika resazuryny do każdej studzienki i kontynuuj inkubację przez 20 minut. Następnie, za pomocą spektrofotometru wielomodowego, wykonaj pomiar fluorescencji, aby oszacować żywotność komórki pod względem względnych jednostek fluorescencji.