Name: Zamknięcie cewy nerwowej w hodowli całego zarodka myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Poznaj metodę hodowli całych zarodków myszy do badania zamknięcia cewy nerwowej w kontrolowanym środowisku. Technika umożliwia bezpośrednią manipulację farmakologiczną i obserwację kluczowych etapów neurulacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować laboratorium A. Hadjantonakisa (Sloan-Kettering Institute) oraz laboratorium L. Niswander (U of Colorado-Denver) za pomocne wskazówki dotyczące technik sekcji i hodowli. Praca ta była wspierana przez granty NRSA NS059562 dla JDG oraz RO1NS05897 dla MER we współpracy z L. Niswander i J. Nadeau (Institute for Systems Biology).

1. Przygotowanie pośrodków hodowlanych - wszystkie odczynniki wymieniono w Tabeli 1
<ol>
	<li>Rozmrozić surowicę szczura samca w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Wyłączyć aktywność cieplną surowicy szczura przez 30 min w temperaturze 55°C.</li>
	<li>Odwirować surowicę szczura przy 10K przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zebrać supernatant i zmieszać w stosunku 50:50 z DMEM w wysokim stężeniu glukozy bez czerwieni fenolowej.</li>
	<li>Zsterylizować medium za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 µm.</li>
	<li>Należy przygotować co najmniej 1 ml medium na jeden embrion.</li>
</ol>
2. Izolacja macicy od ciężarnej samicy
<ol>
	<li>Zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC), ciężarną samicę najpierw znieczula się, a następnie uśmierca poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych</li>
	<li>Sterylizujemy brzuch za pomocą 70% EtOH</li>
	<li>Za pomocą dużych pęsety chwytamy niewielki fragment skóry wzdłuż linii środkowej, tuż nad linią sutków, i otwieramy jamę brzuszną pod pęsetą za pomocą dużych nożyczek. Należy uważać, aby nie uszkodzić struktur wewnętrznych</li>
	<li>Używając nożyczek, wykonujemy cięcia boczne od początkowego otworu w stronę każdej z stron ciała myszy, tak aby cały brzuch był otwarty</li>
	<li>Jelitka i nadmiar tkanki tłuszczowej mogą często zasłaniać macicę; należy je odsunąć, aby górna część macicy i jajniki były widoczne po obu stronach</li>
	<li>Chwytamy górną część macicy poniżej jajników i za pomocą nożyczek oddzielamy macicę od tkanki tłuszczowej, przecinając ją od jednego końca macicy do drugiego jajnika</li>
	<li>Wyjmujemy macicę pęsetą i umieszczamy ją w czarce Petriego z solą fizjologiczną</li>
</ol>
3. Usuwanie zarodków z macicy
<ol>
	<li>Przepłucz macicę solą fizjologiczną, aby usunąć nadmiar krwi, a następnie odetnij nadmiar tłuszczu z zewnętrznej strony</li>
	<li>Przenieś preparat do czystego naczynia z roztworem Tyrodesa o temperaturze pokojowej w celu poprawy widoczności</li>
	<li>Używając stereomikroskopu, odseparuj każdy embrion za pomocą małych nożyczek lub, jeśli jest to konieczne, precyzyjnej pęsety (rozmiar #5), aby ostrożnie rozdzielić ścianę macicy</li>
	<li>Wsuń precyzyjną pęsetę w przestrzeń między ścianą macicy a błoną decydualną i odsunąć ścianę macicy, uważając, aby nie przebić embrionu</li>
</ol>
4. Usuwanie błony podstawnej z embrionów
<ol>
	<li>Ustaw deciduę tak, aby ciemniejsza część (łożysko) była odwrócona od Ciebie</li>
	<li>Za pomocą pincety wykonaj nacięcie wzdłuż linii oddzielającej ciemną część decidui od części jaśniejszej, uważając, aby nie naciąć tkanki zbyt głęboko</li>
	<li>Dokończ oddzielenie łożyska od górnej części pęcherzyka żółtkowego, uważając, aby nie przerwać stożka ektoplacentalnego (EPC). Na tym etapie powinna być widoczna błona Reicherta na pęcherzyku żółtkowym</li>
	<li>Kontynuuj usuwanie całej decidui (części jaśniejszej), uważając, aby nie przebić pęcherzyka żółtkowego</li>
	<li>Delikatnie chwyć i usuń błonę Reicherta, odrywając ją od EPC. Jeśli EPC zostanie uszkodzone lub oddzielone od pęcherzyka żółtkowego, zarodki nie obrócą się prawidłowo w okresie E8.5-E9.5</li>
	<li>Po usunięciu błony Reicherta zarodek powinien być łatwo widoczny przez pęcherzyk żółtkowy; jego stadium można określić poprzez policzenie somytów.</li>
</ol>
5. Konfiguracja systemu hodowli
<ol>
	<li>Odciąć końcówkę plastikowej pipety transferowej nożyczkami, aby zwiększyć średnicę otworu, co umożliwi pobranie zarodka bez uszkodzenia pęcherzyka żółtkowego</li>
	<li>Napełnić czyste butelki walcowe 1 ml pożywki na jeden zarodek. W zależności od rodzaju użytych butelek walcowych, do każdej butelki można wprowadzić maksymalnie 3-6 zarodków.</li>
	<li>Przenieść zarodki za pomocą przyciętej pipety do butelki walcowej wypełnionej pożywką, przenosząc jak najmniejszą ilość roztworu Tyrodes, aby nie rozcieńczać pożywki</li>
	<li>Zamknąć szklaną butelkę walcową od góry gumowym korkiem</li>
	<li>Włożyć butelki walcowe do bębna inkubatora walcowego w taki sposób, aby między korkiem a bębnem wytworzyła się szczelna społeczność</li>
	<li>Po umieszczeniu wszystkich butelek i zabezpieczeniu pustych miejsc w bębnie gumowymi zatyczkami, uruchomić urządzenie walcujące</li>
	<li>Otworzyć butle z CO2 i O2 i ustawić ciśnienie na około 2 psi, tak aby zawór wylotowy uwalniał jedną bańkę na sekundę. Dla zarodków w stadiach E8.5-E10 należy zastosować 20% O2 i 5% CO2.</li>
	<li>Upewnić się, że inkubator jest ustawiony na 37°C, a następnie przykryć lub zamknąć inkubator, aby osłonić zarodki przed światłem.</li>
	<li>Należy okresowo sprawdzać zarodki, aby ocenić ich rozwój na podstawie liczby somytów, postępu obracania oraz stopnia zamknięcia rurki neuralnej</li>
	<li>Po 2-3 godzinach hodowli do pożywki można dodać inhibitory farmakologiczne lub inne czynniki</li>
	<li>Projekt badania powinien obejmować grupy kontrolne, takie jak grupa z samym nośnikiem lub nieaktywnymi analogami odczynnika badawczego.</li>
</ol>
6. Ocena rozwoju po hodowli całego zarodka
<ol>
	<li>Wyłączyć gaz, zatrzymać wałki i wyjąć fiolki z inkubatora</li>
	<li>Przenieść zarodki z powrotem do roztworu Tyrodes lub PBS do szalki Petriego w celu oceny pod stereomikroskopem</li>
	<li>Worek żółtkowy powinien przypominać balon, widoczne powinno być bicie serca z częstotliwością &gt;120 uderzeń na minutę oraz widoczny powinien być krwiobieg</li>
	<li>W razie potrzeby sfotografować zarodki przed usunięciem worka żółtkowego</li>
	<li>Usunąć worek żółtkowy z zarodka, wycinając otwór w pobliżu EPC i przekładając worek żółtkowy oraz błonę owodniową nad głową i tylną częścią zarodka</li>
	<li>Można przeciąć pępowinę, aby oddzielić worek żółtkowy od zarodka; worek żółtkowy można wykorzystać do genotypowania zarodka, jeśli jest to konieczne</li>
	<li>Zbadać zarodek pod kątem liczby somytów i wad cewy nerwowej, takich jak otwarte fałdy czaszkowe, niepełne zamknięcie twarzy i/lub otwarty tylny neuropor. Zarodki można klasyfikować zgodnie z klasyfikacją Theilera opartą na wielokrotnych zmianach morfogenetycznych (<a href="http://genex.hgu.mrc.ac.uk/Databases/Anatomy/MAstaging.html">http://www.emouseatlas.org/ emap/home.html</a>). Ponownie, przydatne jest sporządzenie dokumentacji fotograficznej rozwoju zarodka</li>
</ol>
7. Uwagi
<ol>
	<li>Wysoka jakość sekcji jest kluczowa, ponieważ każde nacięcie lub rozdarcia pęcherzyka żółtkowego uniemożliwią pomyślne odwrócenie i zahamują prawidłowy rozwój. EPC może zostać również uszkodzone podczas usuwania błony Reicherta (RM), a jeśli EPC zostanie choćby częściowo oddzielone od pęcherzyka żółtkowego, embriony nie będą rozwijać się prawidłowo. Z kolei niepełne usunięcie RM może spowodować zlepianie się embrionów i/lub nadmierny rozrost komórek RM w kulturze, co ograniczy ekspansję pęcherzyka żółtkowego; oba te czynniki uniemożliwią prawidłowy rozwój.</li>
	<li>Kluczem do dobrej sekcji są czyste i ostre pęsety, ponieważ tępe lub wygięte narzędzia znacząco utrudniają procedurę. Osady białkowe na instrumentach prowadzą do uszkodzenia tkanek.</li>
	<li>Czyste, sterylne szklane butelki są również niezbędne, aby zapobiec przywieraniu embrionów do ścianek i ich uszkadzaniu. Przed rozpoczęciem eksperymentu butelki należy wyszorować wodą z mydłem, wypłukać w dH2O i podgrzać w kuchence mikrofalowej z niewielką ilością wody w każdej z nich, aż do zagotowania wody. Następnie butelki płucze się 70% EtOH i pozostawia do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Należy pracować tak szybko, jak to możliwe, ponieważ im szybciej embrion zostanie przeniesiony do pożywki hodowlanej i rozgrzany do 37°C, tym większa jest przeżywalność.</li>
	<li>Należy zakończyć sekcję całego miotu przed przeniesieniem jakichkolwiek embrionów do butelek z wałkami, aby każdy embrion pozostawał w temperaturze pokojowej przez ten sam czas, co pozwoli uniknąć rozbieżności w tempie wzrostu embrionów.</li>
	<li>Należy utrzymać sterylne środowisko, aby zapobiec kontaminacji bakteryjnej kultur. Nasze eksperymenty hodowlane były przeprowadzane bez użycia antybiotyków, jednak wiele laboratoriów dodaje antybiotyki do pożywek w celu zapobiegania wzrostowi bakterii. Pożywka pod koniec eksperymentu powinna być tak samo przejrzysta, jak na jego początku. Jeśli pożywka stała się mętna lub widoczny jest osad, prawdopodobnie doszło do kontaminacji kultury.</li>
	<li>Nieefektywna wymiana gazowa może również opóźnić rozwój embrionów, dlatego należy upewnić się, że dysponuje się niezawodnym regulatorem, który zapewni ciągłość dostaw.</li>
	<li>Embriony rozwijają się w kulturze ex vivo około 50% wolniej, dlatego niezbędne jest liczenie somytów, aby upewnić się, że osiągnięto odpowiedni etap rozwoju dla ukończenia eksperymentu.</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki:
Wygląd embrionów przed i po hodowli w rolce przedstawiono na Ryc. 1. W momencie sekcji embriony powinny znajdować się w konfiguracji przed obrotem (Ryc. 1A,D), w której ogon znajduje się za fałdami głowymi. Po 36 h hodowli embriony powinny zakończyć obrót, przyjmując pozycję płodową w kształcie litery C, gdzie ogon znajduje się przed głową (Ryc. 1B,C,E,F). Manipulacja farmakologiczna z użyciem inhibitora kinazy RhoA (Y-27632), znanego inhibitora konwergentnego wydłużania podczas neurulacji (Ybot-Gonzalez, 2007), prowadzi do skrócenia embrionów wzdłuż osi rostralno-kaudalnej (Ryc. 1E,F) i hamuje zamknięcie przednich fałdów neuronalnych. Nasze dane pokazują, że zwiększające się dawki Y-27632 progresywnie upośledzają zamykanie fałdów przednich (Ryc. 2A) i skracają oś ciała (Ryc. 2B), co jest zgodne z rolą sygnalizacji RhoA w neurulacji przedniej i konwergentnym wydłużaniu.
<img alt="Etapy rozwoju zarodka z inhibitorem Y-27632 w stężeniu 5µM i bez niego; wyniki eksperymentalne." src="/files/ftp_upload/3132/3132fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Wygląd hodowli zarodków i manipulacja z użyciem inhibitora farmakologicznego Y-27632. (A,D) Wypreparowane zarodki w stadium E8.5 przed rozpoczęciem hodowli całych zarodków. (B,E) Zarodki w stadium E10 z nienaruszoną jamą żółtkową po 36h hodowli w rotatorze. (C,F) Usunięto jamę żółtkową, aby zilustrować prawidłowe obrócenie i zamknięcie rurki neuralnej. Zarodki poddane działaniu inhibitora kinazy Rho Y-27632 (E,F) nie przeszły prawidłowej konwergentnej elongacji, co objawia się skróceniem osi ciała.
<img alt="Wykres i histogram zależności odpowiedzi od dawki Y-27632; wpływ dawki na %NTC i odległość między pęcherzykiem słuchowym a przednią kończyną." src="/files/ftp_upload/3132/3132fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Wpływ inhibitora kinazy RhoA na zamknięcie przedniej części rurki neuralnej oraz wydłużenie osi ciała. (A) Procent zarodków, które pomyślnie zamknęły fałdy przedniej części rurki neuralnej (%NTC = procent zamknięcia rurki neuralnej) w zależności od dawki Y-27632 dodanej do pożywki hodowlanej. (B) Odległość między pęcherzykiem słuchowym a przednią kończyną była istotnie zredukowana przy zwiększających się dawkach Y-27632 (p&lt;.05).

<ol><li>Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCockroft%2C+DL+%22Mammalian+Postimplantation+Embryos+A+Practical+Approach%22">Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach</a>. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. (1990).</li>
<li>Gray, J. D., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+folate+supplementation+from+Crooked+tail+and+other+NTD-prone+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+A.+Clin.+Mol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).</li>
<li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+MH+%22The+Atlas+of+Mouse+Development%22">The Atlas of Mouse Development</a>. , Academic Press Limited. San Diego. (1992).</li>
<li>Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+extension%2C+planar-cell-polarity+signalling+and+initiation+of+mouse+neural+tube+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure.</a> Development. 134, 789-799 (2007).</li>
<li>Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-environment+interactions%2C+folate+metabolism+and+the+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Syst+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Zdolność do oddzielenia czynników macierzystych, wewnątrzmacicznych, od czynników wewnątrzpochodnych dla embrionu podczas jego rozwoju, stanowi istotne narzędzie w badaniu wszystkich etapów embriogenezy. W niniejszej pracy przeanalizowano wpływ małocząsteczkowego inhibitora kinazy RhoA na neurulację czaszki ex utero, co pozwoliło wyeliminować zmienną w postaci macierzystego metabolizmu leku. Ta manipulacja farmakologiczna wywiera głęboki wpływ na neurulację czaszki oraz konwergentną elongację. Wrażliwość na ten związek można porównywać pomiędzy różnymi genetycznymi mutantami myszy. Przedstawiona tutaj metoda może być również zastosowana w badaniach nad innymi szlakami molekularnymi w rozwoju, umożliwiając bezpośrednią manipulację funkcjami komórkowymi w embrionach przy użyciu różnych odczynników.

<table><tbody><tr><td>Stereomikroskop do sekcji</td><td>Leica Microsystems</td><td>M165</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjny inkubator</td><td>BTC Engineering</td><td>BTC 001</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do rotujących kultur w butelkach</td><td>BTC Engineering</td><td>BTC 003</td><td></td></tr><tr><td>Szklane butelki do urządzenia rotacyjnego</td><td>BTC Engineering</td><td>BTC 005</td><td></td></tr><tr><td>Silikonowy korek gumowy (bung)</td><td>BTC Engineering</td><td>BTC 007</td><td></td></tr><tr><td>Silikonowy korek gumowy</td><td>BTC Engineering</td><td>BTC 008</td><td></td></tr><tr><td>Wlot do przepłukiwacza gazowego</td><td>BTC Engineering</td><td>BTC 012</td><td></td></tr><tr><td>Pułapka wlotowa przepłukiwacza gazowego</td><td>BTC Engineering</td><td>BTC 013</td><td></td></tr><tr><td>Wylot z przepłukiwacza gazowego</td><td>BTC Engineering</td><td>BTC 014</td><td></td></tr><tr><td>Butla z gazem</td><td>Tech Air</td><td></td><td>20% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Regulator gazu</td><td>Tech Air</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica szczura samca</td><td>Harlan Laboratories</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>DMEM bez czerwieni fenolowej</td><td>Invitrogen</td><td>31053</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>Nalge Nunc international</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>Duże nożyczki sekcyjne (tępe końce)</td><td>VWR international</td><td>82027-594</td><td></td></tr><tr><td>Ekstra precyzyjne nożyczki Bonn</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumot #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna Tyrodeo&amp;rsquo;s</td><td></td><td></td><td>Opisana w Cockroft 1990</td></tr><tr><td>Jednorazowa płytka Petri 10 cm</td><td>BD Biosciences</td><td>351029</td><td></td></tr></tbody></table>

zamykanie rurki neuralnej w kulturze całych embrionów myszy

Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Genetyczne modele mysie stanowią istotne narzędzie w badaniu zamykania rurki nerwowej u ssaków (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010). Jednakże badanie embrionów myszy in utero jest ograniczone przez brak możliwości bezpośredniej manipulacji farmakologicznej embrionów w izolacji od wpływu metabolizmu matki na badany odczynnik. Niezależnie od tego, czy stosowana jest mała cząsteczka, białko rekombinowane czy siRNA, dostarczanie tych substancji matce – poprzez dietę lub wstrzyknięcie – naraża te niestabilne związki na szereg mechanizmów obronnych organizmu, co może uniemożliwić ich dotarcie do embrionu. Badania w kulturach całych embrionów mogą być wykorzystane do oddzielenia efektów macierzyńskich od wewnętrznych efektów płodowych w rozwoju.
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy metodę hodowli embrionów myszy z wykorzystaniem wysoko wzbogaconych mediów w inkubatorze obrotowym, która umożliwia prawidłowe zamknięcie rurki neuralnej po sekcji (Crockett, 1990). Po przeniesieniu do hodowli embriony mogą być manipulowane przy użyciu konwencjonalnych technik in vitro, co nie byłoby możliwe, gdyby embriony znajdowały się nadal in utero. Embriony z jednego miotu można pobierać w różnych punktach czasowych, aby badać różne aspekty neurulacji, zachodzącej od E7-7.5 (formowanie płytki neuralnej, tuż przed rozpoczęciem neurulacji) do E9.5-10 (po zakończeniu zamknięcia fałdów czaszkowych i neuroporu tylnego, Kaufman, 1992). W niniejszym protokole demonstrujemy metodę sekcji embrionów w punktach czasowych optymalnych dla badania neurulacji czaszkowej. Embriony zostaną wypreparowane w stadium E8.5 (ok. 10-12 somytów), po rozpoczęciu zamykania rurki neuralnej, ale przed obrotem embrionu i zamknięciem fałdów neuralnych czaszkowych, a następnie utrzymywane w hodowli do E10 (26-28 somytów), kiedy neurulacja czaszkowa powinna być zakończona.

Opisano metodę umożliwiającą bezpośrednią manipulację farmakologiczną embrionów myszy podczas neurulacji z pominięciem metabolizmu matczynego. Technikę tę można dostosować do badania różnych aspektów neurulacji poprzez zmianę punktu czasowego oraz zastosowanego czynnika farmakologicznego.

Zamykanie rurki neuralnej w kulturze całych embrionów myszy

Genetyczne modele mysie stanowią istotne narzędzie w badaniu zamykania rurki neuralnej u ssaków (Gray & Ross, 2009; Ross, 2010). Jednakże badanie myszy...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest monitorowanie zdarzeń w embrionie myszy, w tym elongacji osi neuroaxialnej oraz zamknięcia rurki neuralnej, w środowisku pozamacicznym, w którym można zdefiniować warunki. Jest to realizowane poprzez najpierw usunięcie rogów macicy z znieczulonej ciężarnej myszy w 8,5 dniu gestacji lub rozwoju embrionalnego. Następnie poszczególne embriony myszy są usuwane z macicy wraz z nienaruszonym pęcherzykiem żółtkowym oraz znaczną częścią deciduum.Następnie odcina się nadmiar tkanki decydumy pozazarodkowej, pozostawiając nienaruszony stożek pozapłodowy. Ostatnim etapem procedury jest przeniesienie embrionów wraz z pęcherzykiem żółtkowym do butelek walcowatych zawierających pożywkę z dodatkiem lub bez dodatku testowanych czynników farmakologicznych i hodowanie embrionów przez 18 do 24 godzin w inkubatorze z ciągłym dopływem gazów. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące postępujące dodawanie somytów, zbliżanie się fałdów neuronalnych oraz ich zamknięcie wraz z wygięciem embrionu w charakterystyczny kształt litery c, typowy dla pozycji płodowej.Niniejsza metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w tej dziedzinie, takie jak to, jakie szlaki molekularne biorą udział w prawidłowym zamknięciu rurki neuralnej. Jakie czynniki lub suplementy mogą wspomagać prawidłową owulację, szczególnie w przypadku embrionów z mutacjami genetycznymi predysponującymi do wad cewy nerwowej (NTDs). Demonstracja wizualna tej techniki jest kluczowa, ponieważ etapy sekcji mogą być bardzo wymagające.Zarodki są małe i mogą ulec łatwemu uszkodzeniu, a uszkodzenie pęcherzyka żółtkowego może upośledzić ich dalszy rozwój, rotację oraz rozwój układu krwionośnego, co uniemożliwi uzyskanie pomyślnego rezultatu. Aby rozpocząć, przygotuj medium hodowlane, rozmrażając surowicę szczura samca w temperaturze 37°C. Następnie inaktywuj surowicę szczura przez 30 minut w temperaturze 55°C.Następnie odwiruj zawiesinę przy 10 000 RPM przez pięć minut. W temperaturze pokojowej usuń supernatant i wymieszaj go w stosunku jeden do jednego z DMEM z wysoką zawartością glukozy, bez czerwieni fenolowej. Sterylizuj pożywkę za pomocą filtra strzykawkowego o wielkości oczek 0,45 mikrona.Wyizoluj macicę i umieść ją w szalce Petriego z solą fizjologiczną, aby usunąć zarodki. Najpierw wypłucz macicę solą fizjologiczną, aby usunąć nadmiar krwi, a następnie odetnij nadmiar tkanki tłuszczowej z zewnątrz. Przenieś organ do czystej szalki z roztworem Tyro w temperaturze pokojowej, aby poprawić widoczność pod stereomikroskopem, stabilizując dłonie na stole przedmiotowym.Za pomocą małych nożyczek lub precyzyjnej pincety rozdziel macicę i odseparuj poszczególne zarodki. Wprowadź precyzyjną pincetę w przestrzeń między ścianą macicy a błoną蜕decidua i odsuniesz ścianę macicy, wywierając minimalny nacisk, aby uniknąć przerwania pęcherzyka żółtkowego. Następnie zorientuj błonę蜕decidua tak, aby łożysko było skierowane w stronę przeciwną do badacza.Następnie, za pomocą pęsety, wykonaj nacięcie wzdłuż wyznaczonej linii, oddzielając ciemniejszą część błony białej od części jaśniejszej. Należy uważać, aby nie naciąć zbyt głęboko. Całkowicie oddziel łożysko od górnej części pęcherza owodniowego.Należy zachować ostrożność, aby nie rozerwać stożka pozapłodowego (ecto placental cone lub EPC). Na tym etapie widoczna powinna być błona Rikera na worku żółtkowym. Usunięcie błony Rikera z worka żółtkowego jest najtrudniejszą częścią procedury i wymaga cierpliwości oraz pewnej ręki.Aby delikatnie usunąć błonę riker bez uszkodzenia znajdującego się pod nią pęcherzyka żółtkowego, należy kontynuować usuwanie całej błony macicznej. Uważając, aby nie przebić pęcherzyka żółtkowego, należy delikatnie ucisnąć i usunąć błonę riker, oddzielając ją od EPC. Jeśli EPC zostanie uszkodzone lub oddzielone od pęcherzyka żółtkowego, embriony nie obrócą się prawidłowo w okresie od E 8.5 do E 9.5.Po usunięciu błony Rikera zarodek powinien być łatwo widoczny przez worek żółtkowy. Określ stadium rozwoju zarodka, licząc somity wzdłuż jednej strony, zaczynając od miejsca pod pęcherzykiem słuchowym i kończąc na ogonie. Za pomocą nożyczek odetnij końcówkę plastikowej pipety transferowej, aby móc manipulować zarodkiem bez uszkodzenia worka żółtkowego.Napełnić czyste butelki walcowe jednym mililitrem pożywki na jeden embrion. W zależności od rodzaju zastosowanych butelek walcowych, do każdej butelki można przenieść maksymalnie od trzech do sześciu embrionów. Za pomocą uciętej pipety przenieść embriony do napełnionej pożywką butelki walcowej, przenosząc jak najmniejszą ilość tyrozyny, aby nie rozcieńczać pożywki.Przymocuj gumową zatyczkę do góry szklanej butelki do hodowli w rotatorze. Włóż butelki do bębna rotatora w taki sposób, aby pomiędzy zatyczką a bębnem utworzyła się szczelna blokada. Po zamocowaniu wszystkich butelek należy uszczelnić pozostałe wolne miejsca w bębnie za pomocą gumowych korków.Następnie uruchom wałek. Dalej otwórz zbiornik z mieszaniną CO2 O2 i ustaw go na około dwie PSI, aby zawór wylotowy wypuszczał jedną bańkę na sekundę. W przypadku embrionów E 8.5 i E 10 należy zastosować 20% O2 oraz 5% CO2.Upewnij się, że inkubator jest ustawiony na 37 °C i przykryj lub zamknij inkubator, aby osłonić zarodki przed światłem. Aby ocenić rozwój zarodków, sprawdzaj okresowo pojawianie się somytów, postęp obrotu oraz stopień zamknięcia rurki nerwowej po dwóch do trzech godzinach hodowli; w razie potrzeby dodaj inhibitory farmakologiczne lub inne substancje lecznicze. Po zakończeniu inkubacji wyłącz dopływ gazu, zatrzymaj obrotak i wyjmij butelki z inkubatora.Przenieś zarodki z powrotem do roztworu tyrosu lub PBS do szalki Petriego. Pod mikroskopem stereoskopowym worek żółtkowy powinien przypominać balon, widoczne powinno być bicie serca oraz krążenie krwi. Usuń worek żółtkowy z zarodka, wycinając otwór w pobliżu EPC i przekładając worek żółtkowy oraz owodnię nad głowę i zad zarodka. Przetnij pępowinę, aby oddzielić worek żółtkowy od zarodka.Na koniec należy sprawdzić zarodek pod kątem liczby oraz wad cewy nerwowej, takich jak otwarte fałdy czaszkowe, niepełne zamknięcie twarzy lub otwarty tylny neuropor. Stadia rozwoju zarodków można określić zgodnie z klasyfikacją Tylera w oparciu o liczne zmiany morfogenetyczne. Wygląd zarodków przed i po hodowli rolkowej przedstawiono tutaj w momencie sekcji. Zarodek powinien znajdować się w konfiguracji nieodwróconej, w której ogon znajduje się za fałdami głowowymi.Po 24 godzinach hodowli zarodki powinny zakończyć proces obracania się, przyjmując fetalną pozycję w kształcie litery C, w której ogon znajduje się przed głową. Na górnym rzędzie tego obrazu przedstawiono rozwój zarodków bez dodatku inhibitorów. Dolny rząd obrazuje efekt manipulacji farmakologicznej z użyciem inhibitora kinazy row A Y 2 76 32, będącego znanym inhibitorem konwergentnego wydłużania podczas alacji.Inhibitor ten powoduje skrócenie embrionów wzdłuż osi ogonowej i hamuje zamykanie się fałdów neuronalnych w części głowowej. Nasze dane wykazują, że zwiększające się dawki Y 2 7 6 3 2 progresywnie upośledzają zamykanie fałdów głowowych i skracają oś ciała, co jest zgodne z rolą sygnalizacji row. A w obrębie fałdów neuronalnych głowy oraz w procesie konwergentnego wydłużania. Po opanowaniu technika sekcji może zostać przeprowadzona w czasie od 60 do 90 minut dla miotu od sześciu do 12 embrionów.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć kroki niezbędne do hodowli embrionów myszy w dniach od 8,5 do 10. ciągu ciążowych w celu badania mechanizmów rozwojowych na poziomie systemowym.

neural-tube-closure-in-mouse-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Zamknięcie cewy nerwowej w hodowli całego zarodka myszy

Niniejszy protokół wideo demonstruje zastosowanie testu neurosfer do izolacji i ekspansji komórek macierzystych mózgu z eminencji zwojowych mózgu myszy w 14. dniu embrionalnym.

Ustanowienie hodowli embrionalnych neuralnych komórek macierzystych myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Izolacja embrionalnej grzebieni neuralnej z rurki neuralnej umożliwia zastosowanie metod in vitro do badania migracji, samoodnawiania oraz multipotencji grzebieni neuralnej.

Izolacja i hodowla komórek grzebienia neuronalnego z zarodkowej rurki nerwowej myszy

Mezenchyma czaszki ulega gwałtownym ruchom morfogenetycznym, które prawdopodobnie stanowią siłę napędową dla uniesienia fałdów neuronalnych.1,2W niniejszym opracowaniu opisujemy prostą ex vivo test z eksplantem w celu charakterystyki zachowań komórkowych mezenchymy czaszki podczas neurulacji. Metoda ta znajduje liczne zastosowania, w tym możliwość wprowadzania manipulacji farmakologicznych oraz przeprowadzania analiz z wykorzystaniem obrazowania na żywo.

Test eksplantacyjny do oceny zachowania komórkowego mezenchymy czaszki

W niniejszej pracy opracowujemy narzędzia niezbędne do obrazowania żywych komórek ex vivo w celu śledzenia podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy w stadium...

Ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

Surowica stosowana w hodowlach embrionów zawiera nieznane składniki, które mogą wpływać na wynik eksperymentów, szczególnie w badaniach dotyczących interakcji sygnałowych. Tutaj wykorzystaliśmy system hodowli natlenionej bez surowicy i wykazaliśmy, że zarodki myszy w połowie ciąży hodowane przez 16-40 godzin wykazują rozwój morfologiczny porównywalny z zarodkami rozwijającymi się w macicy.

Rozwój embrionalny myszy w systemie hodowli całych zarodków bez surowicy

Hodowla całego zarodka ssaków (WEC) jest szeroko stosowana w teratologii i biologii rozwojowej. Natychmiast odwirowana surowica szczura jest powszechnie dostarczana jako pożywka zarówno dla myszy, jak i szczurów WEC. W tym filmie pokazujemy nasz standardowy protokół przygotowania wysokiej jakości surowicy szczurzej odpowiedniej dla WEC u ssaków.

Przygotowanie surowicy szczurzej odpowiedniej do hodowli całych zarodków ssaków

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

W tym protokole opisujemy, jak wstrzyknąć lentiwirusowi do mysiej jamy owodniowej w E7.5, prowadząc do jednolitej transdukcji całej płytki nerwowej, przy minimalnym szkodliwym wpływie na przeżycie lub rozwój embrionalny.

Celowanie w mysią płytkę nerwową za pomocą nanoiniekcji in utero (NEPTUNE) w 7. dniu embrionalnym

Ulepszona platforma do hodowli całych zarodków umożliwia ciągły i solidny rozwój ex utero zarodków myszy po implantacji przez okres do sześciu dni, od etapów pregastrulacji do zaawansowanej organogenezy. W tym protokole szczegółowo opisujemy standardową procedurę udanej hodowli zarodków przy użyciu statycznych płytek i systemów obrotowych butelek.

Ex Utero Hodowla zarodków myszy od pregastrulacji do zaawansowanej organogenezy

Ten protokół został opracowany do podłużnego monitorowania właściwości mechanicznych tkanki płytki nerwowej podczas neurulacji zarodka pisklęcia. Opiera się on na integracji mikroskopu Brillouin i systemu inkubacji na etapie, umożliwiającego mechaniczne obrazowanie na żywo tkanki płytki nerwowej w zarodkach piskląt hodowanych ex ovo.

Monitorowanie mechanicznej ewolucji tkanki podczas zamykania cewy nerwowej zarodka pisklęcia

Poznaj metodę hodowli całych zarodków myszy do badania zamknięcia cewy nerwowej w kontrolowanym środowisku. Technika umożliwia bezpośrednią manipulację farmakologiczną i obserwację kluczowych etapów neurulacji.

Zamykanie rurki neuralnej w kulturze całych embrionów myszy

Przeglądaj więcej filmów