Barwienie immunologiczne tkanek twarzoczaszki myszy

Weźmy na przykład kriosekcje utrwalonych embrionalnych tkanek twarzoczaszki myszy zawierających komórki grzebienia nerwowego.

Umyj skrawki w buforze zawierającym niejonowy detergent w celu usunięcia podłoża osadzającego i przepuszczalności membran, umożliwiając dostęp do celów wewnątrzkomórkowych.

Dodaj roztwór blokujący, aby nasycić niespecyficzne miejsca wiązania.

Usuń nadmiar roztworu blokującego. Następnie inkubuj z pierwszorzędowymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko antygenom jądrowym, takim jak czynniki transkrypcyjne i markery proliferacji.

Przemyć buforem w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał.

Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem, aby związać się z przeciwciałami pierwszorzędowymi związanymi z antygenem.

Usunąć niezwiązane przeciwciała za pomocą buforu.

Dodaj podłoże zapobiegające blaknięciu z fluorescencyjnym barwnikiem jądrowym i przykryj szkiełkiem nakrywkowym.

Barwnik barwi jądra, a podłoże zapobiegające blaknięciu chroni sygnały fluorescencyjne podczas obrazowania.

Zobrazuj skrawki pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby ocenić ekspresję i lokalizację markera jądrowego, wskazując na proliferację komórek grzebienia nerwowego i aktywność sygnalizacyjną.

Przepłukać szkiełka w 0,1% PBST trzy razy przez pięć minut każde, aby wypłukać OCT i przepuszczalność skrawków. Dodać 200 mikrolitrów roztworu blokującego do każdego szkiełka i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie usunąć roztwór blokujący bez spłukiwania szkiełka. Dodać 100 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym do każdego szkiełka i inkubować przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Przepłukać szkiełka PBS trzy razy po 10 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 100 mikrolitrów przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Płukać w PBS trzy razy przez 10 minut w temperaturze pokojowej, nadal chroniąc przed światłem. Aby zamontować slajdy, dodaj dwie krople medium zapobiegającego blaknięciu z DAPI na każdy slajd. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym i przechowuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do obrazowania.