Wytwarzanie dopaminergicznych organoidów neuronalnych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Weźmy ludzkie embrionalne komórki macierzyste lub hESC w kolbie pokrytej macierzą zewnątrzkomórkową.

Zastąp pożywkę pożywką do indukcji neuronów i inkubuj, różnicując hESC w kolonie neuronalnych komórek progenitorowych lub NPC.

Dodaj roztwór enzymatyczny, aby oddzielić kolonie.

Odwirować, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce indukcyjnej z czynnikami wzrostu w celu wsparcia różnicowania NPC.

Dodaj zawiesinę komórkową do odwróconych mikrostudzienek w kształcie piramidy, aby utworzyć trójwymiarowe neurosfery.

Przenieś neurosfery na płytkę pokrytą macierzą zewnątrzkomórkową zawierającą pożywkę różnicującą z czynnikami wzrostu i małymi cząsteczkami. Inkubuj pod wpływem pobudzenia, aby promować różnicowanie się w dopaminergiczne neurony progenitorowe.

Zastąp pożywkę pożywką do dojrzewania neuronalnego i umieść neurosfery na krążku błony we wkładce do hodowli, umożliwiając dyfuzję powietrza i składników odżywczych.

Inkubuj w warunkach statycznych, aby utworzyć trójwymiarowe organoidy składające się z dojrzałych neuronów dopaminergicznych.

Te organoidy, naśladujące rozwijający się mózg, są przydatne do badania zwyrodnienia neuronów dopaminergicznych, charakterystycznego dla choroby Parkinsona.

Zastąp pożywkę z komórek macierzystych używaną do utrzymania cech pluripotencji hESC pożywką bez surowicy zawierającą podwójny koktajl hamujący SMAD w celu rozpoczęcia indukcji neuronalnej oraz 10-mikromolowy inhibitor ROCK w celu zwiększenia przeżywalności komórek podczas pasażu następnego dnia. Pierwszego dnia przygotuj płytkę mikrodołkową z 2,5 mililitra na studzienkę pożywki bez surowicy zawierającej to samo stężenie inhibitora ROCK i podwójnych cząsteczek hamujących SMAD.

Aby zróżnicować komórki w kierunku brzusznego wzorca cewy nerwowej, dodaj SHH i FGF8 w ilości 100 nanogramów na mililitr i dwóch mikromolowych wygładzonych agonistów. Po dodaniu pożywki odwirować płytkę z prędkością 1200 g przez pięć minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza z mikrostudzienek. Gdy płytka mikrodołkowa jest gotowa do użycia z pożywką połówkową różniczkową, usuń pożywkę z hESC i szybko przemyj PBS bez chlorku wapnia i magnezu.

Zdysocjuj kolonie w zawiesinę jednokomórkową, dodając 7,5 ml rekombinowanego roztworu enzymatycznego do kolby T75. Inkubować komórki przez dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie dodać 7,5 DMEM F-12. Następnie zebrać zawiesinę komórkową i odwirować w ilości 300 razy g przez pięć minut. Następnie usuń supernatant i policz komórki w tym samym podłożu, które zostało użyte do przygotowania płytki mikrodołkowej.

Dostosuj objętość pożywki, aby uzyskać zawiesinę komórkową, pozwalającą na utworzenie neurosfer zawierających 1,000 komórek na mikrostudzienkę, przygotowując 4,7 miliona komórek w 2,5 mililitra pożywki i dodając ją do poprzednich 2,5 mililitrów pożywki już umieszczonej na płytce. Aby prawidłowo rozprowadzić komórki w każdej mikrostudzince, delikatnie potrząśnij płytką i odwiruj ją w ilości 300 razy g przez pięć minut. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny, aby wytworzyć kule.

Drugiego dnia delikatnie przepłucz mikrodołki pożywką i przenieś kulki na sześciodołkową płytkę poddaną działaniu tkanki. Umieść kulki w ruchu obrotowym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i zmieniaj połowę podłoża na świeże co dwa do trzech dni. W dniach od 3 do 13, aby zwiększyć indukcję neuronalną i przekształcić się w neuronalne komórki progenitorowe z tożsamością śródmózgowia, uzupełnij podłoże trzema mikromolowymi inhibitorami GSK-3-beta. Podziel próbkę na dwie nowe, potraktowane tkankowo płytki z sześcioma dołkami, aby zmniejszyć gęstość kuli i uniknąć agregacji kulek.

Ósmego dnia rozpocznij dojrzewanie neuronalne, przełączając się na nową pożywkę z czynnikami wzrostu i zmieniaj pożywkę co dwa do trzech dni. W dniu 21 umieść jedną wkładkę płytki hodowlanej w jednym dołku nowej płytki sześciodołkowej i dodaj 1,2 mililitra pożywki do dojrzewania neuronów używanej do różnicowania neurosfery pod wkładką błonową. Następnie umieść membranę PTFE na wkładce płytki hodowlanej.

Wreszcie, aby wygenerować organoid nerwowy, zasiej około 100 neurosfer w warunkach granicy faz powietrze-ciecz na membranie PTFE. Zatrzymaj rotację od tego kroku i zmieniaj podłoże co dwa do trzech dni, aż do osiągnięcia wymaganego punktu czasowego różnicowania.