JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:27 min • July 8th, 2025
Weźmy pierwotne nerwowe komórki macierzyste i progenitorowe oraz neurony, które mają sialoglykoproteiny oznaczone przez reporter kwasu sjalowego.
Dodaj paraformaldehyd, aby utrwalić komórki. Usunąć nadmiar paraformaldehydu za pomocą buforu.
Inkubować z mieszaniną reakcyjną zawierającą sondy chemiczne na bazie biotyny, środek redukujący i katalizator na bazie metalu.
Środek redukujący aktywuje katalizator, ułatwiając biotynylację sialoglykoprotein.
Usunąć mieszaninę reakcyjną i przemyć buforem. Dodać streptawidynę sprzężoną z fluoroforem, aby związać biotynylowane sialoglykoproteiny.
Usunąć niezwiązaną streptawidynę i przemyć buforem. Dodaj białka i niejonowy detergent, aby zablokować niespecyficzne miejsca i przepuszczalność komórek.
Usuń ten roztwór i inkubuj z pierwszorzędowymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko określonym białkom komórkowym.
Usunąć niezwiązane przeciwciała.
Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi fluoroforem i barwnikiem fluorescencyjnym, aby związać przeciwciała pierwszorzędowe związane z białkiem i znakować jądra.
Usuń niezwiązane cząsteczki. Umyć buforem.
Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej zobrazuj komórki, aby uwidocznić fluorescencyjne sjalolikoproteiny i białka komórkowe.
Najpierw usuń wkładki z płytek kokultury i zaaspiruj pożywkę hodowlaną z dna studzienek. Następnie umyj komórki nerwowe raz podgrzanym PBS. Odessać PBS ze studzienek i dodać 1 mililitr wstępnie schłodzonego 4% paraformaldehydu w PBS do każdej studzienki.
Utrwal komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie umyj komórki trzykrotnie schłodzonym PBS. Odessać PBS i dodać 1 mililitr świeżo przygotowanego buforu I sprzężonego z biotyną do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie odessać bufor reakcyjny ze studzienek i trzykrotnie przemyć komórki PBS. Dodaj 1 mililitr buforu barwiącego do każdej studzienki komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
Następnie odessać bufor barwiący ze studzienek i trzykrotnie przemyć komórki wstępnie schłodzonym PBS. Dodaj 1 mililitr buforu blokującego do każdej studzienki komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Usuń bufor blokujący z dołków i dodaj 1 mililitr roztworu przeciwciał pierwszorzędowych do każdej studzienki. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Następnego dnia usuń pierwszorzędowy roztwór przeciwciała z dołków. Umyj komórki trzykrotnie wstępnie schłodzonym PBS. Odessać PBS z dołków i dodać 1 mililitr przeciwciała wtórnego do każdej studzienki. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Następnie odessać roztwór ze studzienek i trzykrotnie umyć komórki wstępnie schłodzonym PBS.