Ocena in vitro zagregowanego β amyloidu na zapadanie się stożka wzrostu neuronów

Rozpocznij od wielodołkowego szkiełka hodowlanego zawierającego neurony z zarodka myszy w pożywce.

Neurony wykazują stożki wzrostu na końcach swoich rosnących aksonów. Struktury te obejmują cienkie wypustki zwane filopodiami i arkuszowe przedłużenia zwane lamellopodiami, które składają się z włókien aktynowych i mikrotubul, składników cytoszkieletu.

Studzienki testowe należy potraktować zagregowanym białkiem β amyloidu lub Aβ, a studzienki kontrolne roztworem nośnika.

W studzienkach testowych zagregowany Aβ wiąże się z receptorami błonowymi, inicjując dalszą sygnalizację, która fosforyluje białka regulujące cytoszkielet.

Fosforylowane białka rozrywają filamenty aktynowe i mikrotubule, destabilizując integralność strukturalną stożka wzrostu i powodując jego zapadanie się.

Inkubuj z utrwalaczem, aby zachować strukturę komórkową, a następnie umyj komórki i zamontuj je do obrazowania.

Za pomocą mikroskopu porównaj struktury komórkowe w studzienkach testowych i kontrolnych.

Zwiększone występowanie zapadania się stożka wzrostu w neuronach traktowanych Aβ wskazuje na toksyczne działanie agregatów Aβ.

Rozpocznij ten test co najmniej tydzień wcześniej, otwierając świeżą fiolkę z uzyskanym w handlu, pełnowymiarowym A-beta-42 i rozpuszczając zawartość w sterylnej wodzie destylowanej do stężenia 0,5 milimola. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez siedem dni w celu wywołania agregacji i toksyczności. Przygotować porcje zagregowanego A-beta-42 i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu użycia.

W czwartym dniu hodowli neuronalnej należy potraktować studzienki 100 mikrolitrami 0,5 mikromolowego zagregowanego A-beta-42 lub roztworu nośnika w pożywce B przez jedną godzinę, jak wykazano wcześniej. Po upływie godziny usuń pożywkę hodowlaną i natychmiast utrwal neurony 4% paraformaldehydem zawierającym 4% sacharozy w PBS przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na gorącej płycie.

Utrwalenie jest przede wszystkim ważne, ponieważ utrzymanie kształtu stożków wzrostu ma kluczowe znaczenie dla tego protokołu.

Po utrwaleniu przemyj neurony trzykrotnie PBS. Następnie, po wyjęciu komory, zamontuj neurony za pomocą wodnego podłoża montażowego. Suszyć podłoże montażowe w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez dwa do czterech dni. Uchwyć cały obszar każdej studzienki za pomocą 20-krotnej suchej soczewki obiektywowej pod odwróconym mikroskopem.

Uchwycenie i przeanalizowanie całego obszaru w każdej studni jest ważne dla uniknięcia subiektywizmu.

Sklasyfikuj najdłuższe neuryty każdego neuronu w stadium 3 lub 4 jako aksony. Stożki wzrostu aksonów pozbawione blaszek lub posiadające mniej niż trzy filopodia są uważane za zapadnięte stożki wzrostu.