Wizualizacja peptydów beta-amyloidu w wycinkach ludzkiej kory mózgowej

Weźmy szklane szkiełko zawierające korowy wycinek tkanki mózgowej pobrany od pacjenta z chorobą Alzheimera. Tkanka zawiera nierozpuszczalne złogi beta-amyloidu w miąższu i naczyniach włosowatych mózgu.

Zanurz szkiełko w rozcieńczonym alkoholu, aby usunąć lipidy i sole.

Przemyć alkoholem bezustannym, aby odwodnić tkankę, a następnie nałożyć utrwalacz, aby zachować architekturę tkanki.

Odkurz szkiełko, usuwając wilgoć.

Potraktuj parą kwasu mrówkowego w wilgotnym środowisku, aby rozbić agregaty beta-amyloidu na mniejsze rozpuszczalne peptydy.

Za pomocą skanera optycznego wygeneruj obrazy cech strukturalnych tkanki, aby zinterpretować dane z obrazowej spektrometrii mas.

Rozpyl roztwór matrycy na próbkę.

Za pomocą spektrometru mas zastosuj laser, który matryca absorbuje, aby zjonizować peptydy. Następnie detektor identyfikuje je na podstawie ich stosunku masy do ładunku.

Przeanalizuj dane, aby uzyskać obrazy, ujawniające rozkład peptydów beta amyloidu w miąższu tkanek i naczyniach włosowatych mózgu.

Aby przepłukać skrawki tkanki, zanurz próbki w 40 do 100 mililitrach 70% etanolu w szklanym słoiku do barwienia na 30 sekund, aby usunąć endogenne lipidy i sole nieorganiczne. Umyć próbki, stosując sekwencję mycia wymienioną w protokole tekstowym. Następnie suszyć próbki w próżni przez 30 minut.

Teraz potraktuj skrawki tkanek parą kwasu mrówkowego, aby uzyskać lepszą jonizację białek beta-amyloidu z tkanki mózgowej z autopsji. Aby to zrobić, przygotuj piekarnik w temperaturze 60 stopni Celsjusza i szklane naczynie do inkubacji z 5 mililitrami 100% kwasu mrówkowego. Utrzymuj wilgotność powietrza w szklanym naczyniu do inkubacji na poziomie nasycenia.

Umieść szkiełka tkankowe w szklanym naczyniu do inkubacji, unikając zanurzenia w kwasie mrówkowym i traktuj przez sześć minut. Wykonaj obraz optyczny próbek za pomocą skanera do filmów, skanera żelowego lub mikroskopu cyfrowego. Wykonaj ten krok w temperaturze pokojowej.

Wyrównanie obrazu optycznego próbek jest konieczne, gdy cel próbki jest umieszczony wewnątrz urządzenia. Zazwyczaj nie będzie możliwe rozpoznanie sekcji tkankowej znajdującej się pod warstwą matrycy. Aby skorelować obrazy optyczne z próbkami, należy wykonać znaki prowadzące, które są widoczne zarówno na obrazie optycznym, jak i pod warstwą matrycy w optyce kamery. Najprostszym sposobem jest dostrzeżenie co najmniej trzech śladów płynu korekcyjnego wokół próbki przed wykonaniem obrazu optycznego.

Aby spryskać matrycę opryskiwaczem ultradźwiękowym, należy usunąć z eksykatora tkankę do rozpylania i umieścić ją w komorze. Upewnij się, że chusteczka nie zakrywa okienka czujnika. Rozpocznij przygotowanie, naciskając przycisk Start. Zwykle czas przygotowania wynosi około 90 minut.

Przygotowanie będzie regulowane automatycznie poprzez monitorowanie grubości warstwy matrycy i wilgotności. Alternatywnie, aby rozpylić roztwór matrycy na powierzchnię tkanki za pomocą automatycznego opryskiwacza, użyj systemu pompy rozpuszczalnika ustawionego na 10 PSI i 0,15 mililitra na minutę, aby dostarczyć roztwór matrycy.

Stały przepływ podgrzanego gazu osłonowego będzie dostarczany razem z natryskiwaniem roztworu matrycy. Wykonuj eksperymenty z obrazowaniem o wysokiej przepustowości i wysokiej rozdzielczości przestrzennej za pomocą MALDI-IMS. W przypadku pomiarów spektrometrii mas należy zdefiniować obszary tkanek za pomocą oprogramowania sterującego MALDI i oprogramowania do analizy danych.

Uzyskaj widma w dodatnim trybie liniowym o zakresie stosunku masy do ładunku od 2 000 do 20 000 i rozdzielczości przestrzennej 20 i 100 mikronów. Aby uzyskać wzorzec kalibracyjny, rozpuść wzorzec kalibracji peptydu w wzorcu kalibracji białka w stosunku 1 do 4 z CHCA w roztworze TA30, a następnie rozcieńcz go 10 razy.

Umieść 1 mikrolitr wzorca kalibracyjnego na szkiełku w czterech różnych miejscach. Korzystając z oprogramowania do histologii molekularnej, nałóż na siebie wiele obrazów sygnałów, aby znaleźć korelację przestrzenną różnych sygnałów, takich jak różne peptydy beta-amyloidu kolokalizujące się w blaszkach starczych w ścianach tętnic.