JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:25 min • July 8th, 2025
Zacznij od przylegającej hodowli neuronów traktowanej alfa-synukleiną lub agregatami alfa-S, które są grudkami nieprawidłowo sfałdowanego białka.
Te grudki agregują się, tworząc inkluzje wewnątrzkomórkowe.
Zastąp pożywkę roztworem utrwalającym, aby zachować integralność komórkową.
Usunąć roztwór utrwalający i przemyć buforem.
Następnie dodaj środek powierzchniowo czynny, aby przeniknąć przez błonę komórkową.
Usunąć środek powierzchniowo czynny i przemyć buforem.
Wprowadzić roztwór blokujący, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał.
Teraz inkubuj z pierwszorzędowymi przeciwciałami, które wiążą się specyficznie z inkluzjami alfa-S i białkami strukturalnymi.
Przemyć buforem w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał.
Inkubować z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi.
Usuń niezwiązane przeciwciała.
Dodaj barwnik fluorescencyjny, aby oznaczyć jądro.
Usuń plamę i umyj buforem.
Za pomocą podłoża montażowego zamontuj szkiełko nakrywkowe z neuronami na szkiełku.
Pod mikroskopem fluorescencyjnym obserwuj immunoznakowane inkluzje alfa-S w neuronie.
Aby przeprowadzić immunofluorescencję w chemicznym okapie, utrwal neurony za pomocą 2% paraformaldehydu w PBS i 5% roztworu sacharozy przez 15 minut w temperaturze pokojowej bez wstrząsania. Po 15 minutach usuń roztwór utrwalający i krótko przemyj neurony trzykrotnie PBS.
Następnie przepuszczaj neurony za pomocą 0,3% niejonowego środka powierzchniowo czynnego w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie krótko umyj neurony trzykrotnie PBS. Inkubuj neurony z 3% FBS w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania. Następnie inkubować neurony z odpowiednim pierwotnym przeciwciałem rozpuszczonym w 3% FBS w PBS przez noc w chłodni lub lodówce przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza na wytrząsarce orbitalnej.
Następnego dnia usuń roztwór przeciwciała i krótko przemyj komórki PBS trzy razy. Następnie inkubuj neurony z odpowiednim fluorescencyjnym przeciwciałem drugorzędowym rozpuszczonym w 3% FBS w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności na wytrząsarce orbitalnej.
Usunąć roztwór przeciwciał i przemyć krótko PBS trzy razy. Następnie barwić neurony roztworem DAPI przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności na wytrząsarce orbitalnej. Po 15 minutach usunąć roztwór przeciwciała i krótko przemyć PBS trzy razy. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełku za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu.