Model in vitro uszkodzeń rozciągających w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych

Zacznij od wielodołkowej płytki bez dna przymocowanej do silikonowej membrany. Membrana jest pokryta biopolimerem, aby ułatwić adhezję komórek.

Wprowadź do studzienek indukowane przez człowieka pluripotencjalne neurony pochodzące z komórek macierzystych lub hiPSCN, zawieszone w pożywce. Pożywka jest uzupełniana macierzą zewnątrzkomórkową lub białkami ECM w celu zwiększenia adhezji komórek.

Inkubuj płytkę, pozwalając komórkom przylegać do białek ECM i biopolimeru, promując równomierną interakcję z powierzchnią błony.

Następnie zabezpiecz płytkę na etapie urządzenia do urazu.

Za pomocą urządzenia nałóż wgłębienie na membranę, aby wygenerować kontrolowane naprężenia mechaniczne na neuronach.

Stres zaburza pracę cytoszkieletu, co powoduje zwyrodnienie wypukłości komórkowych zwanych neurytami i powstawanie niewielkich obrzęków wzdłuż neurytów.

Stres uszkadza również integralność błony komórkowej, powodując śmierć komórki.

HiPSCN wykazujące fenotyp urazu rozciągającego są teraz gotowe do analizy.

Aby rozciągnąć płytę, zmień pola "Nazwa pliku" i "Ścieżka pliku" w instrumencie wirtualnym "Śledzenie pozycji" na unikalną nazwę pliku i kliknij strzałkę Uruchom. Ustaw głębokość i czas trwania wcięcia w polach "Kontuzja" i "Czas trwania urazu" w wirtualnym instrumencie panelu sterowania ruchem. Gdy płyta znajduje się w pozycji zerowej, uruchom instrument wirtualny "Panel sterowania ruchem" i kliknij Zranij, aby wciąć płytę.

Kliknij przycisk Góra, aby przesunąć scenę w górę, kliknij przycisk Zatrzymaj, gdy płyta znajduje się w górnym położeniu, a następnie otwórz drzwiczki, aby dezaktywować urządzenie do uszkadzania. Następnie sprawdź historię przemieszczeń etapu przedstawioną w wirtualnym instrumencie "Position Tracker", aby potwierdzić, że zastosowano określone maksymalne przemieszczenie, i wyeksportuj dane do odpowiedniego programu arkusza kalkulacyjnego.

Aby ocenić rozciągliwość membrany silikonowej po obróbce plazmowej, umieść płytkę na miękkiej powierzchni i zagruntuj mały występ na stemplu tuszem z markera permanentnego. Włóż stempel do pierwszego dołka, który ma być przetestowany, i stuknij, aby zapewnić dobry transfer atramentu. Po wytłoczeniu wszystkich studzienek umieść szybką kamerę na stojaku na wysięgniku nad urządzeniem do urazu, z obiektywem ustawionym na najmniejszy ponumerowany przysłonę, tak aby pole widzenia zawierało 12 wgłębników w siatce 3 na 4.

Gdy tabliczka znajduje się w pozycji punktu zerowego, kliknij przycisk nagrywania w oprogramowaniu aparatu, aby pojawił się napis "Trigger In" i włącz jasne, rozproszone światło osiowe, a następnie wciąć płytę, jak właśnie pokazano, i wyłącz światło osiowe.

Aby uszkodzić hodowlę komórkową, dodaj 100 mikrolitrów ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z lamininy do każdego dołka płytki poddanej działaniu osocza i pozwól komórkom przyłączyć się do dna płytki na 15 minut w temperaturze pokojowej, przed umieszczeniem płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po 2 do 3 dniach hodowli zaciśnij płytkę na etapie urządzenia do uraziania i wyreguluj położenie pokrywy, aby zabezpieczyć płytkę bez wystawiania kultur na działanie otaczającego powietrza. Następnie, gdy tabliczka znajduje się w pozycji punktu zerowego, wciąć płytkę, jak pokazano poniżej.