$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Pobrać płytkę wielodołkową zawierającą transfekowane komórki ssaków.
Komórki te wyrażają receptor zapachowy (OR) neuronu węchowego, receptor sprzężony z białkiem G, wraz z biosensorem cAMP zawierającym domenę wiążącą cAMP połączoną ze zmutowaną lucyferazy.
Usunąć pożywkę i przemyć buforem, aby usunąć pozostałą pożywkę.
Dodaj bufor zawierający substrat biosensora cAMP. Inkubować, aby ułatwić wchłanianie substratu do komórek.
Za pomocą czytnika płytek chemiluminescencyjnych zmierz podstawową luminescencję komórek.
Dodać rosnące stężenie testowego środka zapachowego do studzienek, pozostawiając jedną studzienkę nietraktowaną jako kontrolę.
Środek zapachowy wiąże się z salą operacyjną i wyzwala kaskadę sygnalizacyjną, która wytwarza cAMP.
Ten cAMP wiąże się z domeną wiążącą biosensora, aktywując lucyferazę, która oddziałuje z substratem, emitując światło.
Mierz luminescencję w czasie rzeczywistym. Wzrost luminescencji przy wyższych stężeniach nawaniacza wskazuje na aktywację OR przez nawaniacz.
Przed stymulacją obserwuj transfekowane komórki pod mikroskopem z kontrastem fazowym, aby zapewnić prawidłową konfluencję od 50% do 80% na studzienkę przed powrotem do inkubatora. Następnie przygotuj pożywkę stymulacyjną, dodając 10 milimolowych HEPE'ów i 5 milimolowych glukoz do zbilansowanego roztworu soli Hanka. Rozmrozić 55-mikrolitrowe podwielokrotności odczynników substratowych do cyklicznego testu AMP w czasie rzeczywistym na lodzie.
Przygotować 2% roztwór równoważący, mieszając 55 mikrolitrów odczynnika substratowego i 2 750 mikrolitrów pożywki stymulującej. Po rozłożeniu grubej warstwy ręczników papierowych na ławce, delikatnie i wielokrotnie postukaj talerzem do góry nogami o ręczniki papierowe, tak aby medium transfekcyjne zostało wchłonięte przez ręczniki papierowe. Umyj komórki, pipetując 50 mikrolitrów pożywki stymulacyjnej do każdej studzienki.
Delikatnie i wielokrotnie wystukaj pożywkę stymulającą z 96-dołkowej płytki. Odpipetować 25 mikrolitrów 2% roztworu równoważącego do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 2 godziny. Przed zakończeniem czasu inkubacji rozcieńczyć rozmrożone roztwory podstawowe nawaniacza do stężenia roboczego w podłożu stymulacyjnym
.
Przed dodaniem środka zapachowego należy użyć czytnika płytek chemiluminescencyjnych, aby zmierzyć podstawowy poziom luminescencji płytki. Szybko wyjmij płytkę z czytnika płytek i dodaj 25 mikrolitrów rozcieńczonych nawaniaczy do każdej studzienki. Następnie natychmiast rozpocznij ciągły pomiar luminescencji wszystkich studzienek przez 20 cykli w ciągu 30 minut.