JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:30 min. • July 8th, 2025
Pobrać płytkę wielodołkową zawierającą transfekowane komórki ssaków.
Komórki te wyrażają receptor zapachowy (OR) neuronu węchowego, receptor sprzężony z białkiem G, wraz z biosensorem cAMP zawierającym domenę wiążącą cAMP połączoną ze zmutowaną lucyferazy.
Usunąć pożywkę i przemyć buforem, aby usunąć pozostałą pożywkę.
Dodaj bufor zawierający substrat biosensora cAMP. Inkubować, aby ułatwić wchłanianie substratu do komórek.
Za pomocą czytnika płytek chemiluminescencyjnych zmierz podstawową luminescencję komórek.
Dodać rosnące stężenie testowego środka zapachowego do studzienek, pozostawiając jedną studzienkę nietraktowaną jako kontrolę.
Środek zapachowy wiąże się z salą operacyjną i wyzwala kaskadę sygnalizacyjną, która wytwarza cAMP.
Ten cAMP wiąże się z domeną wiążącą biosensora, aktywując lucyferazę, która oddziałuje z substratem, emitując światło.
Mierz luminescencję w czasie rzeczywistym. Wzrost luminescencji przy wyższych stężeniach nawaniacza wskazuje na aktywację OR przez nawaniacz.
Przed stymulacją obserwuj transfekowane komórki pod mikroskopem z kontrastem fazowym, aby zapewnić prawidłową konfluencję od 50% do 80% na studzienkę przed powrotem do inkubatora. Następnie przy
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych