JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 5:05 min. • July 8th, 2025
Zacznij od znieczulonej myszy z odsłoniętą czaszką. Mysz jest zabezpieczona w stereotaktycznej ramce zawierającej strzykawkę wstępnie wypełnioną podatnymi na agregację białkami beta amyloidu.
Zaznacz bregmę, kluczowy punkt odniesienia do określania współrzędnych infuzji białka.
Przesuń strzykawkę i dotknij bregmy, a następnie lambdy, aby określić współrzędne grzbietowo-brzuszne, zapewniając precyzyjną głębokość igły.
Zmień położenie strzykawki powyżej wcześniej ustalonej współrzędnej przyśrodkowo-bocznej, celując w zakręt zębaty, kluczowy dla przetwarzania pamięci.
Dotknij powierzchni czaszki, upewniając się, że współrzędna grzbietowo-brzuszna mieści się w limicie, i zaznacz ją. Powtórz tę procedurę po przeciwnej stronie.
Wywierć oznaczoną współrzędną przyśrodkowo-boczną, wstrzyknij białka beta amyloidu do zakrętu zębatego i przytrzymaj, aby zapobiec przepływowi wstecznemu.
Wywierć i wstrzyknij białka beta-amyloidu po przeciwnej stronie, aby uzyskać równomierną dyspersję białek.
Odłącz nauszniki od myszy, a następnie zszyj nacięcie.
Z biegiem czasu białka beta amyloidu agregują się, tworząc blaszki, które degradują neurony zakrętu zębatego i zakłócają przetwarzanie pamięci, powodując chorobę Alzheimera.
Wykonaj skalpelem 2- do 3-milimetrowe nacięcie w linii środkowej skóry głowy. Użyj prostych, cienkich nożyczek, aby przedłużyć linię nacięcia do około 1,0 centymetra, aby odsłonić szew strzałkowy, bregmę i lambdę czaszki. Następnie użyj kleszczy, aby rozsunąć skórę.
Oczyść czaszkę sterylnym wacikiem nasączonym sterylną solą fizjologiczną. Następnie użyj czystego, suchego bawełnianego wacika, aby wysuszyć czaszkę. Następnie zaznacz kropkę na bregmie. Ustawić strzykawkę Hamiltona za pomocą mikromanipulatora tak, aby końcówka igły dotykała kropki na bregmie. Następnie zapisz współrzędną DV.
Zaznacz kropkę w punkcie lambda. Upewnij się, że oś AP czaszki jest wypoziomowana, przesuwając strzykawkę do tyłu do punktu lambda. Końcówka igły powinna dotykać punktu lambda, tak jak dotykała punktu bregma. Następnie zapisz pozycję DV. Współrzędne DV dla bregmy i lambdy powinny mieścić się w granicach 0,5 milimetra.
Teraz przywróć końcówkę igły do kropki bregma. Zapisz początkową pozycję AP. Następnie oblicz końcową pozycję AP, odejmując 2 milimetry od początkowej współrzędnej AP i zmień położenie igły strzykawki na końcową współrzędną AP.
Następnie zarejestruj bieżącą współrzędną uczenia maszynowego. Oblicz lewe i prawe końcowe współrzędne ML, dodając lub odejmując 1,3 milimetra od początkowej współrzędnej ML i przesuń igłę strzykawki do końcowych współrzędnych ML. Przyłóż końcówkę igły do powierzchni czaszki na obu końcowych współrzędnych ML i upewnij się, że współrzędne DV mieszczą się w granicach 0,5 milimetra.
Będąc na końcowej współrzędnej ML, pociągnij igłę w górę 0,5 do 1 centymetra nad czaszką. Zaznacz kropkę na czaszce ciemnym, bardzo cienkim markerem. Powtórz ten krok dla przeciwległej strony czaszki. Następnie odsunąć strzykawkę.
Wywierć otwór po lewej lub prawej współrzędnej ML na czaszce za pomocą wiertła 0,8 milimetra. Powtórz ten krok dla strony przeciwnej. Następnie przenieść strzykawkę do jednego z nowo wprowadzonych otworów. Opuść igłę tuż za czaszkę i uważaj, aby nie przebić mózgu.
Aby upewnić się, że igła przeszła przez czaszkę, delikatnie dociśnij igłę do czaszki, aby upewnić się, że igła nie wyjdzie z otworu. Następnie zapisz początkową współrzędną DV. Oblicz końcową współrzędną DV, odejmując 2,2 milimetra od początkowej współrzędnej DV i opuść wskazówkę do końcowej współrzędnej DV.
Następnie ustaw stereotaktyczną pompę wtryskiwacza tak, aby wlewała 4 mikrolitry Aβ1-42 do zakrętu zębatego z szybkością 0,5 mikrolitra na minutę. Po infuzji należy pozostawić igłę na miejscu przez dodatkową minutę, aby zminimalizować cofanie się roztworu z miejsca wstrzyknięcia. Następnie przesuń igłę na drugą stronę mózgu i powtórz procedurę.
Teraz odkręć nauszniki. Użyj standardowych kleszczyków uczniowskich, aby zamknąć skórę głowy i uszczelnić ranę szwem. Zdejmij osłonę nosa i wyjmij mysz.