JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:58 min. • July 8th, 2025
Weź stały, transgeniczny embrionalny przewód pokarmowy myszy na pożądanym etapie rozwoju.
Jelitowy układ nerwowy przewodu pokarmowego obejmuje neurony jelitowe i neurony cholinergiczne wyrażające acetylotransferazę choliny.
Te neurony cholinergiczne wyrażają również białko fluorescencyjne napędzane przez promotor acetylotransferazy choliny.
Inkubuj przewód z niejonowym detergentem i białkami, aby przeniknąć komórki i zapobiec wiązaniu się nieswoistych przeciwciał.
Zastąp przeciwciałami pierwszorzędowymi. Inkubuj przeciwciała, aby związać swoje docelowe białka odpowiednio w neuronach.
Usunąć niezwiązane przeciwciała i przemyć buforem.
Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem, aby specyficznie związać przeciwciała pierwszorzędowe związane z białkami docelowymi.
Usunąć nadmiar przeciwciał i przemyć buforem.
Zanurz oznakowany odcinek w pożywce montażowej zawierającej barwnik jądrowy w celu zabarwienia jąder. Teraz zamontuj szkiełko nakrywkowe.
Za pomocą mikroskopii konfokalnej wizualizuj i analizuj rozmieszczenie neuronów cholinergicznych w przewodzie pokarmowym.
Umieść drogi pokarmowe w 0,2-mililitrowej probówce zawierającej roztwór blokujący, składającej się z 1x PBS, 3% albuminy surowicy bydlęcej, 0,1 Triton X-100 i kołysz przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po zablokowaniu odessać roztwór blokujący za pomocą pipety Pasteura z cienką końcówką i zastąpić optymalnym rozcieńczeniem przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w roztworze blokującym.
Inkubuj przez cztery godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza na platformie bujanej. Po inkubacji przeciwciał pierwotnych odessać roztwór przeciwciała i przepłukać przewód pokarmowy w PBS trzy razy przez pięć minut każdy, a następnie przez godzinę w temperaturze pokojowej z kołysaniem.
Po ostatnim praniu zastąp PBS przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem rozcieńczonymi w roztworze blokującym i umieść probówki na platformie bujanej w ciemności na cztery godziny w temperaturze pokojowej lub na noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Po umyciu przewodów GI jak poprzednio, umieść kilka kropli fluorescencyjnego podłoża montażowego z DAPI na szkiełku podstawowym, a następnie zanurz przewód GI w podłożu montażowym i dodaj szkło nakrywkowe. Na koniec uchwyć obrazy każdego fluoroforu za pomocą mikroskopu konfokalnego, a następnie wykonaj komputerową analizę obrazu za pomocą odpowiedniego oprogramowania.