Obrazowanie poklatkowe w celu monitorowania transkomórkowego rozprzestrzeniania się białek podobnych do prionów u nicień transgenicznych

Weźmy na przykład nicienie transgeniczne, które utrzymują się na tym samym etapie rozwoju.

Komórki mięśniowe ściany ciała tych nicieni wyrażają białka podobne do prionów, które są oznaczone czerwonym białkiem fluorescencyjnym i zlokalizowane w kwaśnych pęcherzykach.

Białka podobne do prionów są nieprawidłowo sfałdowane, agregując białka, które są związane z chorobami neurodegeneracyjnymi.

Następnie przenieś nicienie na podkładkę agarozową zawierającą nanocząstki polimerowe i roztwór znieczulający.

Połączone działanie nanocząsteczek i roztworu znieczulającego unieruchamia nicienie na poduszce agarozowej.

Umieść szkiełko nakrywkowe na waciku agarozowym i zamknij go.

Teraz umieść zespół padów agarozowych z nicieniami pod mikroskopem konfokalnym i ustaw odpowiednie parametry obrazowania.

Zdobądź obrazy poklatkowe białek znakowanych fluorescencyjnie w nicieniach, aby monitorować transport pęcherzykowy białek podobnych do prionów w komórkach mięśniowych ściany ciała i między nimi.

Po przygotowaniu zsynchronizowanych linii transgenicznych kontroli i domeny prionowej C. elegans oraz 10% wabiotek agarozowych zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym, należy odpipetować 3 mikrolitry 100 nanogramów kulek polistyrenowych i 3 mikrolitry 4-milimolowego lewamizolu do podkładki agarozowej. Za pomocą szpikulca z drutu platynowego przenieś robaki w pożądanym wieku z płytki do roztworu i użyj szkiełka nakrywkowego do przykrycia.

Aby zobrazować robaki na poziomie subkomórkowym, umieść szkiełko w uchwycie szkiełek mikroskopu konfokalnego i użyj obiektywu olejowego 63X lub 100X/1.4 NA. Następnie otwórz MetaMorph i wybierz "Wielowymiarowe pozyskiwanie", a pod główną zakładką zaznacz pola "Upływ czasu" i "Uruchom dzienniki". W zakładce "Zapisywanie" wybierz lub utwórz folder katalogu do zapisywania plików i przypisz mu nazwę.

W zakładce "Długość fali" użyj "YokoQuad Red" lub równoważnego oświetlenia obrazowania MRP i dostosuj ekspozycję do zakresu od 100 do 300 milisekund, a wzmocnienie aparatu do zakresu od 100 do 300. Następnie w zakładce "Timelapse" ustaw Interwał czasowy na 1 sekundę, "Czas trwania" na 5 minut, a "Liczba punktów czasowych" na 301.

W zakładce "Dzienniki" dla Dziennika wybierz "AFC SET Z HOLD" i "AFC Return to Z HOLD". W polu Typ wybierz dwukrotnie opcję "Specjalny", a w polu Punkt początkowy wybierz "Początek punktu czasowego" i "Koniec punktu czasowego". Po zakończeniu konfiguracji naciśnij "Pobierz".