Wstrzyknięcie wektora wirusowego do istoty czarnej szczura w celu modelowania chorób neurodegeneracyjnych

Zabezpiecz znieczulonego szczura w ramce stereotaktycznej.

Zdezynfekuj skórę głowy i wykonaj nacięcie w linii środkowej czaszki, aby odsłonić czaszkę.

Zidentyfikuj bregmę i lambdę, dwa punkty odniesienia na czaszce, aby określić miejsce wstrzyknięcia.

Przygotować strzykawkę do mikroiniekcji zawierającą zawiesinę wektora wirusowego.

Wektor wirusowy przenosi transgen kodujący alfa-synukleinę, białko, które ulega nieprawidłowemu fałdowaniu i agregacji w neuronach istoty czarnej w chorobach neurodegeneracyjnych.

Umieścić strzykawkę w przyrządzie stereotaktycznym podłączonym do pompy do mikroiniekcji.

Utworzyć otwór w miejscu wstrzyknięcia, unikając uszkodzenia mózgu.

Przebij oponę twardą igłą i oczyść krew sterylną tkanką.

Wprowadzić igłę do mikroiniekcji przez otwór w zadziorach, aby dotrzeć do istoty czarnej.

Powoli wstrzyknąć zawiesinę wirusa, zapewniając równomierne rozprowadzenie.

Zatrzymaj się na chwilę, aby zapobiec cofaniu się, a następnie powoli wyjmij igłę.

Zszyj nacięcie.

Model jest teraz gotowy do dalszej analizy.

Zacznij od odpowiedniego znieczulenia ośmiotygodniowej samicy szczura rasy Wistar zgodnie z zatwierdzonymi protokołami. Sprawdź, czy chirurgiczny plan znieczulenia został osiągnięty, ściskając każdą łapę i zauważając brak odruchu wycofania. Następnie użyj implantatora mikrotranspondera, aby umieścić mikrotransponder na grzbiecie szczura. Sprawdź, czy mikrotransponder jest prawidłowo umieszczony i czy można uzyskać odczyt

Teraz odetnij włosy na skórze głowy szczura i nałóż znieczulenie miejscowe na skórę głowy i uszy. Przenieś szczura do okapu z przepływem laminarnym i wykonaj resztę procedury przy użyciu techniki aseptycznej. Umieść szczura w ramce stereotaktycznej, zabezpieczając nauszniki, a następnie pasek na usta i nos. Przykryj ciało szczura papierowym kocem, aby uniknąć spadku temperatury ciała. Zastosuj lubrykant do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu.

Następnie zdezynfekuj skórę głowy zgodnie z zatwierdzonymi procedurami. Stosuje się tutaj 1% jodu w 70% izopropanolu. Po wykonaniu małego nacięcia w linii środkowej skóry głowy delikatnie zeskrob błony na czaszce i spłucz solą fizjologiczną. Po pozostawieniu czaszki do wyschnięcia upewnij się, że bregma i lambda są wyraźnie widoczne.

Teraz napełnij strzykawkę do mikroiniekcji o pojemności 10 mikrolitrów i rozmiarze 30 mm i średnicy 20 milimetrów rekombinowanym AAV i umieść ją na zmotoryzowanej pompie do mikroiniekcji podłączonej do instrumentu stereotaktycznego.

Do specyficznej transdukcji neuronów dopaminergicznych istoty czarnej, rekombinowane wektory AAV są pierwszym wyborem ze względu na ich wysokie miana i skuteczność transdukcji neuronów dopaminergicznych.

Przetestuj przepływ, uwalniając kroplę AAV. Uwolniony AAV należy wyrzucić do wielowartościowego detergentu czyszczącego. Sprawdź wzrokowo, czy głowica jest zamocowana prosto w ramie głowicy. Następnie sprawdź, czy czaszka jest płaska, najpierw przesuwając końcówkę igły do bregmy i mierząc wysokość w tym miejscu, opuszczając końcówkę igły w kierunku grzbietowo-brzusznym, aż dotknie czaszki. Powtórz procedurę przy lambdzie.

Po powrocie igły do bregmy, przesunąć igłę w kierunku przednio-tylnym i przyśrodkowo-bocznym do współrzędnych stereotaktycznych do mikroiniekcji. Zapisz współrzędne. W miejscu wstrzyknięcia należy zmierzyć wysokość czaszki jak poprzednio i upewnić się, że nie różni się ona o więcej niż 0,3 milimetra od wysokości bregmy.

Następnie ostrożnie wywierć 2-milimetrowy otwór w czaszce. Po wywierceniu otworu zmierz wysokość opony twardej, aby określić odniesienie, od którego należy zastosować współrzędną grzbietowo-brzuszną. Przebić oponę twardą za pomocą igły o rozmiarze 26. Wchłonąć krew za pomocą sterylnej tkanki i kontynuować dopiero po ustaniu krwawienia.

Teraz powoli opuść igłę wstępnie załadowanej strzykawki do mikroiniekcji do mózgu do współrzędnej grzbietowo-brzusznej i zatrzymaj się na jedną minutę. Następnie wstrzyknij trzy mikrolitry AAV z szybkością 0,25 mikrolitra na minutę. Po wstrzyknięciu należy pozostawić igłę na miejscu przez kolejne pięć minut, aby zapobiec cofaniu się wzdłuż ścieżki igły, a następnie należy ją powoli wyjąć.

Zszyj skórę głowy za pomocą powlekanego plecionego poliestru 3.0 i zdezynfekuj skórę 1% jodem w 70% izopropanolu, aby poluzować pasek na nos i usta, a następnie dwa paski uszne, aby delikatnie usunąć zwierzę z instrumentu stereotaktycznego. W tym czasie należy podać środek przeciwbólowy i, jeśli to konieczne, środek odwracający znieczulenie. Następnie umieść szczura w czystej klatce na płycie grzewczej ustawionej na 38 stopni Celsjusza i uważnie monitoruj, aż się obudzi.