Izolacja nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiej pośmiertnej tkanki mózgowej

Rozpocznij od zamrożonej pośmiertnej próbki ludzkiej tkanki mózgowej z potwierdzonego przypadku choroby neurodegeneracyjnej.

Wyciąć szarą masę bogatą w nierozpuszczalne agregaty białkowe, które są cechą charakterystyczną choroby.

Przenieść tkankę do homogenizatora.

Dodaj bufor zawierający inhibitory i homogenizuj w celu uwolnienia składników wewnątrzkomórkowych.

Inhibitory blokują enzymy proteazy i fosfatazy, zapobiegając degradacji białek.

Przenieś homogenat do probówki i dodaj jonowy bufor detergentowy. Inkubować.

Detergent rozpuszcza natywnie pofałdowane białka, podczas gdy nieprawidłowo sfałdowane agregaty białkowe pozostają nienaruszone.

Sonicate w celu całkowitej dysocjacji komórkowej.

Przenieść homogenat do probówki ultrawirówkowej i odwirować z dużą prędkością.

Agregaty osiadają na dnie.

Usunąć sklarowany nad osadem zawierający białka rozpuszczalne w detergentach.

Przemyć agregaty jonowym buforem detergentowym, odwirować i usunąć supernatant.

Dodaj bufor mocznikowy, aby zdenaturować agregaty białkowe, czyniąc je rozpuszczalnymi.

Przenieś rozpuszczone agregaty białkowe do probówki i krótko poddaj sonikacji, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie.

Uzyskaj zamrożoną pośmiertną tkankę mózgową od zdrowej grupy kontrolnej i patologicznie potwierdzonej choroby Alzheimera. Użyj kleszczy i żyletki, aby wyciąć około 250 miligramów części istoty szarej z każdej próbki tkanki. Pozwól segmentowi mózgu rozmrozić się przez minutę. Teraz pokrój kawałek tkanki w kostkę na około dwumilimetrowe kawałki sześcienne, gdy się rozmraża. Przenieś do dwumililitrowej, wstępnie schłodzonej rurki homogenizatora z dounce na lodzie.

Pamiętaj, aby unikać istoty białej i wszelkich dużych naczyń krwionośnych.

Pracuj szybko i umieść chusteczkę na jednorazowych łodziach do ważenia. Należy uważać, aby zapobiec rozmrożeniu tkanki, często umieszczając łódkę wagową z tkanką mózgową w polistyrenowych pojemnikach z suchym lodem. Po wypreparowaniu i zważeniu wszystkich wymaganych kawałków tkanki wyjmij łódkę ważącą zawierającą kawałek tkanki z suchego lodu.

Następnie dodaj pięć mililitrów lodowatego buforu o niskiej zawartości soli z koktajlem inhibitorów proteazy i fosfatazy na gram tkanki i homogenizuj na lodzie, używając około 10 pociągnięć tłuczka A o wysokim prześwicie i 15 pociągnięć tłuczka B o niskim prześwicie. Następnie użyj dziewięciocalowej szklanej pipety Pasteura, aby przenieść każdy homogenat do oznakowanej dwumililitrowej probówki polipropylenowej. Pozostałą homogenację przelać do dodatkowych oznakowanych probówek o pojemności 1,5 mililitra w podobny sposób do przechowywania w temperaturze -80 stopni Celsjusza.

Aby kontynuować frakcjonowanie, dodaj 100 mikrolitrów pięciu molowych chlorków sodu i 100 mikrolitrów 10% sarkozylu do każdej 0,8-milimetrowej podwielokrotności. Dobrze wymieszaj przez odwrócenie, a następnie inkubuj na lodzie przez 15 minut. Po inkubacji użyj sonikatora wyposażonego w sondę z mikrokońcówką, aby dostarczyć trzy 5-sekundowe impulsy o amplitudzie 30%.

Po zastosowaniu metody kwasu bicinchoninowego w celu oznaczenia stężeń białek w homogenatach, do każdej próbki dodać lodowaty bufor Sark z inhibitorami proteazy i fosfatazy do końcowego stężenia 10 miligramów na milimetr. Następnie przenieś 500 mikrolitrów każdej próbki do 500 mikrolitrowych probówek ultrawirówek z poliwęglanu.

Załaduj probówki do wstępnie schłodzonego wirnika i ultrawiruj pod ciśnieniem 180 000 razy g przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po odwirowaniu przenieś rozpuszczalne supernatanty sarkozylu S1 do 1,5-mililitrowych probówek i przechowuj w temperaturze -80 stopni Celsjusza. Dodać 200 mikrolitrów buforu Sark do probówek ultrawirówek zawierających nierozpuszczalne w detergentach frakcje P1 i użyć końcówki pipety, aby usunąć granulki z dna probówek ultrawirówek.

Następnie przenieś zawieszone granulki P1 do nowych probówek ultrawirówek o pojemności 500 mikrolitrów, zrównoważ pary i odwiruj pod ciśnieniem 180 000 razy g przez dodatkowe 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant S2, a następnie dodać 50 do 75 mikrolitrów buforu mocznikowego z proteazą i koktajlem inhibitorów fosfatazy do nierozpuszczalnych osadów sarkozylu i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu rozpuszczenia osadu P2.

Po inkubacji przenieś zawieszone granulki P2 do oznakowanych probówek 0,5 milimetra i całkowicie rozpuść granulki za pomocą krótkiej, 1-sekundowej sonikacji mikrokońcówki o amplitudzie 20%. Oznaczyć stężenia białek we frakcjach rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych w sarkozylu przy użyciu metody oznaczania BCA.