Badanie przenikania FITC i FITC-ferrytyny przez model bariery krew-mózg in vitro

Rozpocznij od płytki wielodołkowej zawierającej barierę krew-mózg in vitro lub model bariery krew-mózg lub model BBB.

Model ten składa się z komórek śródbłonka przylegających do górnej lub krwionośnej strony oraz astrocytów po dolnej lub mózgowej stronie wkładki membranowej pokrytej matrycą.

Dodać izotiocyjanian fluoresceiny lub FITC, barwnik fluorescencyjny, do górnej komory studzienki kontrolnej.

I odwrotnie, dodaj ferrytynę obciążoną FITC lub ferrytynę FITC do górnej komory dołka próbki, a następnie inkubuj.

W studzience kontrolnej wolny FITC pozostaje ograniczony do górnej komory, z minimalnym przejściem przez BBB.

Tymczasem w dołku próbki kompleksy FITC-ferrytyna wiążą się z receptorami na komórkach śródbłonka.

Umożliwia to internalizację i transport za pośrednictwem receptora do dolnej komory.

Następnie regularnie pobieraj pożywkę z dolnych komór obu studzienek i mierz intensywność fluorescencji.

Kontrola wykazuje niższą fluorescencję, podczas gdy próbka wykazuje wyższą fluorescencję, co potwierdza różnicową przepuszczalność BBB dla FITC i FITC-ferrytyny.

Aby zmierzyć przepływ ferrytyny FITC przez układ barierowy krew-mózg, dodaj ferrytynę obciążoną FITC lub wolny FITC do górnej części co najmniej trzech systemów bariery krew-mózg dla każdej formuły.

Po siedmiu godzinach w inkubatorze pobrać 2 mililitry pożywki z dolnych komór trzech wkładek do próbek i kontroli. Zmierzyć intensywność fluorescencji 500 mikrolitrów pobranych próbek za pomocą spektrofluorometru i określić stężenie przenikanej ferrytyny FITC lub FITC, zgodnie z instrukcjami zawartymi w pisemnej części protokołu.