JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:47 min. • July 8th, 2025
Weźmy perfundowane, niedokrwienne tkanki mózgowe myszy zawierające komórki mózgowe i infiltrowane komórki odpornościowe.
Zmielić chusteczki na sitku i spłukać buforem.
Odwirować filtrat i odrzucić supernatant.
Zawiesić osad w roztworze enzymu trawiennego i przenieść go do probówki do mikrowirówki.
Inkubuj, aby enzymy trawienne rozbiły macierz zewnątrzkomórkową, rozluźniając komórki.
Przefiltrować zawiesinę i przepłukać buforem zawierającym DNazę w celu usunięcia zanieczyszczającego DNA.
Następnie przemyć buforem wolnym od DNaz.
Odwirować filtrat i odrzucić supernatant.
Ponownie zawieś komórki w podłożu o gradiencie gęstości. Następnie przenieś zawartość do świeżej probówki i wymieszaj. Odwirować, aby oddzielić składniki według gęstości.
Usunąć sklarowany osad zawierający mielinę i inne zanieczyszczenia.
Ponownie zawiesić osad w buforze wolnym od DNaz. Przenieś go do nowej probówki i ponownie odwiruj.
Odrzucić supernatant w celu zapewnienia wystarczającego usunięcia pożywki o gradiencie gęstości.
Na koniec ponownie zawieś komórki w buforze do dalszej analizy.
Używając końcówki tłoka 5-mililitrowej strzykawki, rozgnieć kawałki tkanki mózgowej przez sitko do komórek o średnicy 100 mikronów, ciągle płucząc sitko lodowatym HBSS z wapniem i magnezem. Następnie umieść homogenizowane tkanki na lodzie.
Gdy wszystkie próbki zostaną przetworzone, odwirować zawiesiny komórek. I ostrożnie wyrzuć supernatanty. Zawiesić granulki w 1 mililitrze buforu wytrawiającego. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do 2-mililitrowej probówki.
I inkubuj komórki pod powolną, ciągłą rotacją w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po godzinie przesiej zawiesinę komórek przez sitko do komórek o średnicy 70 mikronów. I dokładnie wypłukać filtr 3 mililitrami buforu płuczącego zawierającego DNazę. Następnie umyj sitko 15 mililitrami buforu myjącego bez DNaz. Odkręć komórki i odrzuć supernatant.
Aby usunąć resztki komórek i mielinę, ponownie zawieś komórki w 5 mililitrach pożywki o gradiencie gęstości 25% o temperaturze pokojowej i przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki. Dokładnie wymieszać komórki i dokonać gradientu, kilkakrotnie delikatnie pipetując. Następnie odwiruj roztwór komórkowy.
Pod koniec rozdzielania ostrożnie zassać płaszcz mielinowy i supernatant, nie naruszając osadu. I ponownie zawieś komórki w 10 mililitrach buforu płuczącego wolnego od DNaz. Przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki i ponownie je odwiruj, ponownie zawieszając granulat w 100 mikrolitrach buforu do mycia na zimno.