Uzyskiwanie zawiesin komórkowych z niedokrwionych tkanek mózgowych myszy

Weźmy perfundowane, niedokrwienne tkanki mózgowe myszy zawierające komórki mózgowe i infiltrowane komórki odpornościowe.

Zmielić chusteczki na sitku i spłukać buforem.

Odwirować filtrat i odrzucić supernatant.

Zawiesić osad w roztworze enzymu trawiennego i przenieść go do probówki do mikrowirówki.

Inkubuj, aby enzymy trawienne rozbiły macierz zewnątrzkomórkową, rozluźniając komórki.

Przefiltrować zawiesinę i przepłukać buforem zawierającym DNazę w celu usunięcia zanieczyszczającego DNA.

Następnie przemyć buforem wolnym od DNaz.

Odwirować filtrat i odrzucić supernatant.

Ponownie zawieś komórki w podłożu o gradiencie gęstości. Następnie przenieś zawartość do świeżej probówki i wymieszaj. Odwirować, aby oddzielić składniki według gęstości.

Usunąć sklarowany osad zawierający mielinę i inne zanieczyszczenia.

Ponownie zawiesić osad w buforze wolnym od DNaz. Przenieś go do nowej probówki i ponownie odwiruj.

Odrzucić supernatant w celu zapewnienia wystarczającego usunięcia pożywki o gradiencie gęstości.

Na koniec ponownie zawieś komórki w buforze do dalszej analizy.

Używając końcówki tłoka 5-mililitrowej strzykawki, rozgnieć kawałki tkanki mózgowej przez sitko do komórek o średnicy 100 mik