Wykrywanie starzenia się neuronów w korowym przekroju organoidowym

Zacznij od szkiełka zawierającego cienką część organoidu korowego, który zawiera komórki glejowe i neurony na różnych etapach starzenia.

Starzejące się neurony, w stanie starzenia się ze spadkiem funkcji komórek, zawierają wysoki poziom beta-galaktozydazy.

Sekcja jest wstępnie traktowana utrwalaczem w celu ustabilizowania struktury komórkowej i środkiem przepuszczalnym w celu przepuszczalności ich błon.

Umieść szkiełko w pojemniku do barwienia, aby przemyć buforem w celu usunięcia wszelkich śladów roztworu.

Wybarwić szkiełko roztworem zawierającym substrat enzymu beta-galaktozydazy i rozpocząć inkubację.

Substrat dostaje się do komórek, gdzie beta-galaktozydaza rozszczepia substrat, wytwarzając produkt o niebieskim kolorze, który gromadzi się więcej w starzejących się neuronach.

Kilkakrotnie umyj sekcję.

Dodaj mocowanie zapobiegające blaknięciu i pozwól mu zastygnąć, zapewniając integralność poplamionej sekcji.

Obserwuj szkiełko pod mikroskopem; obszar z produktem o intensywnym niebieskim kolorze wskazuje na starzenie się neuronów w organoidzie.

Po kriosekcji organoidów należy usunąć nadmiar roztworu montażowego, przenosząc szkiełka do stojącego pojemnika ze szkiełkiem z pokrywką i przemyć podzieloną tkankę organoidu trzykrotnie PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie inkubuj szkiełka przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza ze świeżo przygotowanym roztworem barwiącym beta-galaktozydazę. Przemyć zabarwione tkanki trzykrotnie PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia roztworu beta-galaktozydazy.

Teraz zamontuj umyte chusteczki za pomocą szklanego środka mocującego zapobiegającego blaknięciu i pozwól roztworowi montażowemu zestalić się przez 30 minut w temperaturze pokojowej przed obejrzeniem go pod mikroskopem.