Barwienie immunohistochemiczne białka S-100 w biopsji odbytniczej

Weź stałe biopsje ssania ludzkiego odbytnicy z odsłoniętymi antygenami białkowymi i inaktywowanymi endogennymi peroksydazami.

Dodaj roztwór blokujący, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał.

Zastąp roztwór blokujący pierwszorzędowymi przeciwciałami, które wiążą się z docelowym białkiem komórek glejowych, S-100, markerem choroby Hirschsprunga.

Usuń niezwiązane przeciwciała i inkubuj z polimerami peroksydazy, aby wzmocnić sygnał.

Umyć, aby usunąć nadmiar polimeru. Dodaj przeciwciała drugorzędowe, które wiążą się z polimerami enzymatycznym i przeciwciałami pierwszorzędowymi.

Usuń niezwiązane przeciwciała i dodaj substrat chromogenny.

Peroksydazy reagują z podłożem, tworząc kolorowy osad.

Spłucz, aby usunąć nadmiar osadu.

Dodaj barwnik, aby zabarwić jądra.

Umyć roztworem kwasu i etanolu, aby usunąć nadmiar barwnika.

Następnie odwodnić skrawki za pomocą rosnących stężeń etanolu, a następnie ksylenu.

Na koniec zamontuj i obserwuj pod mikroskopem, aby uwidocznić barwienie wskazujące na obecność docelowego białka.

Wyrzuć nadmiar albuminy surowicy bydlęcej i oznacz komórki 50 mikrolitrami podstawowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka spłucz szkiełka trzema trzyminutowymi płukaniami w PBS i dodaj 50 mikrolitrów wzmacniacza polimerowego do każdego szkiełka. Po 20 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza umyj szkiełka trzykrotnie w PBS i dodaj 50 mikrolitrów wtórnego przeciwciała B do każdego odcinka tkanki.

Po 30 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza spłucz sekcje trzema pięciominutowymi płukaniami w PBS i dodaj kroplę świeżo przygotowanego roztworu roboczego DAB do każdego szkiełka. Gdy odpowiedni poziom brązowego zabarwienia zostanie wykryty za pomocą mikroskopii świetlnej, należy płukać szkiełka w PBS przez pięć minut i przeciwbarwić jądra jedną kroplą hematoksyliny przez jedną minutę.

Usuń nadmiar plamy pod strużką wody przez około 30 do 40 sekund, a następnie umyj ją w świeżym PBS na 25 do 30 sekund. Różnicować tkanki w 1% etanolu z kwasem solnym przez 10 sekund, a następnie przemyć je jednominutowym PBS.

Odwodnić szkiełka przez pięciominutowe zanurzenia w odwrotnej kolejności nawodnienia i wystawić szkiełka na dwie pięciominutowe zmiany ksylenu. Następnie zamontuj szkiełko nakrywkowe za pomocą mocowania ultraclean i pozwól szkiełkom wyschnąć przed ich wizualizacją pod mikroskopem świetlnym.