Wywoływanie ukierunkowanego uszkodzenia neuronów za pomocą lasera o dużej mocy u larwy Drosophila

Umieść znieczuloną larwę Drosophila głową do góry na kropli oleju na szklanym szkiełku zawierającym plamy tłuszczu próżniowego.

Umieść szkiełko nakrywkowe i delikatnie dociśnij je, aby zetknąć się z larwą.

Dostosuj larwę tak, aby odsłoniła obszar zawierający docelowe neurony wyrażające białka fluorescencyjne.

Zabezpiecz szkiełko w mikroskopie dwufotonowym.

Użyj lasera o małej mocy, aby zminimalizować uszkodzenia i zeskanuj larwę, aby zlokalizować obszar z fluorescencyjnymi neuronami docelowymi.

Następnie dostosuj okno skanowania, aby skupić się na regionie docelowym zawierającym aksony, rodzaj projekcji neuronalnych.

Teraz zmniejsz szybkość skanowania i zwiększ moc lasera.

Laser o dużej mocy uderzy w docelowe aksony, generując miejscowe ciepło, które je uszkadza i wzmacnia fluorescencję wokół miejsca urazu.

Na koniec przełącz się z powrotem na tryb lasera o małej mocy. Obecność małych kraterowych, pierścieniowatych struktur w miejscu urazu potwierdza udane uszkodzenie neuronów.

Zacznij od znieczulenia larw. W dygestorium umieść szklane naczynie o średnicy 60 milimetrów w 15-centymetrowej plastikowej szalce Petriego. Następnie złóż kawałek bibuły i umieść go w szklanym naczyniu. Umieść płytkę z agarem winogronowym na tkance po dodaniu eteru dietylowego. Następnie na szklanym szkiełku umieść jedną kroplę oleju halocarbon 27 na środku i umieść plamę smaru próżniowego na każdym z czterech rogów.

Następnie za pomocą kleszczy przenieś jedną larwę na płytkę agarową i przykryj szklane naczynie, aby znieczulić larwę. Gdy tylko larwa przestanie się poruszać, ostrożnie przenieś ją do oleju halowęglowego z głową w pozycji pionowej. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku i delikatnie dociśnij je, aż dotknie larwy. Następnie użyj delikatnej siły, aby przesunąć szkiełko nakrywkowe, aby przetoczyć komórki, które mają zostać poddane ablacji, do miejsca, w którym najłatwiej uderzy w nie laser dwufotonowy. Lokalizacja będzie się różnić w zależności od tego, jakie neurony są celowane.

Teraz zabezpiecz zespół na stoliku mikroskopu dwufotonowego i skup się na interesujących Cię komórkach za pomocą 40-krotnego obiektywu zanurzeniowego w olejku. W oprogramowaniu przełącz się na tryb skanowania i załaduj zapisany protokół. Upewnij się, że otwór jest całkowicie otwarty. Następnie, w trybie Na żywo, uzyskaj dobry obraz interesującego Cię regionu. Następnie zatrzymaj skanowanie na żywo, aby przycisk Przytnij stał się dostępny. Korzystając z funkcji Przytnij, dostosuj okno skanowania, aby skupić obszar docelowy tylko na potencjalnym miejscu urazu.

Następnie otwórz nowe okno obrazowania. Teraz zmniejsz prędkość skanowania i zwiększ intensywność lasera. Następnie przełącz przycisk ciągły, aby rozpocząć i zatrzymać skanowanie. Obserwuj uważnie. Gdy tylko nastąpi drastyczny wzrost fluorescencji, zakończ skanowanie. Następnie wróć do oryginalnego okna obrazowania i wybierz tryb Na żywo i znajdź obszar, który był właśnie docelowy, dostosowując ostrość.

Dobrym wskaźnikiem udanego urazu jest pojawienie się małego krateru, struktury przypominającej pierścień lub zlokalizowanych szczątków bezpośrednio w miejscu urazu. Gdyby moc lasera była zbyt duża, widoczny byłby duży obszar uszkodzeń, co może być śmiertelne.