JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:19 min. • July 8th, 2025
Zacznij od przylegającej hodowli dojrzałych ludzkich neuronów na płytce pokrytej matrycą.
Dodać wektory lentiwirusowe kodujące zmutowane ludzkie białko tau połączone z reporterem białka żółtej fluorescencji (YFP).
lentiwirus przyłącza się do określonych receptorów powierzchniowych komórek neuronalnych, umożliwiając fuzję błony wirusa-gospodarza oraz uwalnianie wirusowego RNA i enzymów.
Wirusowe RNA jest odwrotnie transkrybowane do DNA.
Integraza wirusowa transportuje DNA do jądra, ułatwiając integrację z genomem gospodarza i prowadząc do produkcji zmutowanego białka tau znakowanego YFP.
Z biegiem czasu zmutowane tau tworzy agregaty cytoplazmatyczne w transdukowanych komórkach.
Umyj komórki świeżą pożywką, aby usunąć niezinternalizowane cząsteczki wirusa.
Kontynuuj inkubację z regularnymi zmianami pożywki, aby utrzymać żywotność neuronów i promować agregację białek.
Wizualizuj neurony pod mikroskopem.
Pomyślnie transdukowane neurony wykazują cytoplazmatyczne agregaty zmutowanego białka tau znakowanego fluorescencyjnym YFP.
Aby transdukować neurony za pomocą lentiwirusa, użyj liczby miana wynoszącej 340 000 jednostek transdukcyjnych na komórkę. Rozcieńczyć jednostki ulegające transdukcji w pożywce do hodowli komórkowej do wymaganego stężenia i dodać je do komórek.
Dwa dni po dodaniu lentiwirusa należy raz przemyć komórki świeżą pożywką, która nie zawiera bFGF.
Kontynuuj hodowlę komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla w pożywce bez bFGF. Utrzymuj komórki przez około osiem tygodni po transdukcji, upewniając się, że zmieniasz pożywkę do hodowli komórkowych co drugi dzień. Użyj mikroskopu świetlnego, aby rutynowo zwizualizować komórki i zapewnić ich żywotność.