Test lucyferazy do pomiaru aktywności γ-sekretazy w komórkach ludzkich

Zacznij od genetycznie zmodyfikowanych komórek ludzkich w pożywce wzrostowej.

Komórki te zawierają system indukowany tetracykliną, posiadający białko prekursorowe amyloidu lub gen APP oraz gen lucyferazy.

Wymienić z pożywką zawierającą tetracyklinę i inkubować.

Tetracyklina wiąże się z białkiem aktywatora, które z kolei wiąże się z promotorem APP.

To indukuje ekspresję genów i wytwarza białka prekursorowe, które lokalizują się w błonie komórkowej.

Enzym β-sekretaza rozszczepia APP, wytwarzając fragment, który pozostaje przyczepiony do błony komórkowej.

γ-sekretaza rozszczepia ten fragment, wytwarzając peptydy β amyloidu i uwalniając składnik aktywujący.

Aktywator ten dostaje się do jądra, wiąże się z promotorem lucyferazy, indukuje ekspresję genów i wytwarza enzymy lucyferazy.

Zastąp pożywkę odczynnikiem testowym zawierającym substrat lucyferazy. Substrat dyfunduje do komórek i reaguje z lucyferazą, wytwarzając bioluminescencję.

Użyj czytnika mikropłytek, aby zmierzyć natężenie światła, które bezpośrednio odzwierciedla aktywność γ-sekretazy, enzymu kluczowego w stanach neuropatologicznych.

Policz komórki NG lub CG za pomocą hemocytometru. Następnie wysiewaj komórki w ilości 20 000 komórek na studzienkę na 96-dołkowych mikropłytkach o końcowej objętości 200 mikrolitrów na studzienkę w pożywce wzrostowej. Przenieś mikropłytki do nawilżonego inkubatora dwutlenku węgla i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Po całonocnej inkubacji usuń 100 mikrolitrów pożywki wzrostowej z każdej studzienki.

Dodać 100 mikrolitrów na studzienkę pożywki wzrostowej zawierającej 2 mikrogramy na mililitr tetracykliny z 0,2% dimetylosulfotlenkiem, dwoma mikromolowymi CL 387, 785, dwoma mikromolowymi DAPT lub innymi pokrewnymi inhibitorami ErbB1 / ErbB2. Inkubować leczone komórki na mikropłytkach w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po inkubacji usunąć 150 mikrolitrów pożywki wzrostowej na studzienkę z mikropłytek.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów na studzienkę odczynnika do oznaczania lucyferazy. Następnie przenieś mikropłytki do czytnika mikropłytek luminescencyjnych i utrzymuj je w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Określ luminescencję emitowaną przez lucyferazy świetlika za pomocą predefiniowanego programu zapisanego w czytniku mikropłytek luminescencyjnych.