JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:59 min. • July 8th, 2025
Zacznij od genetycznie zmodyfikowanych komórek ludzkich w pożywce wzrostowej.
Komórki te zawierają system indukowany tetracykliną, posiadający białko prekursorowe amyloidu lub gen APP oraz gen lucyferazy.
Wymienić z pożywką zawierającą tetracyklinę i inkubować.
Tetracyklina wiąże się z białkiem aktywatora, które z kolei wiąże się z promotorem APP.
To indukuje ekspresję genów i wytwarza białka prekursorowe, które lokalizują się w błonie komórkowej.
Enzym β-sekretaza rozszczepia APP, wytwarzając fragment, który pozostaje przyczepiony do błony komórkowej.
γ-sekretaza rozszczepia ten fragment, wytwarzając peptydy β amyloidu i uwalniając składnik aktywujący.
Aktywator ten dostaje się do jądra, wiąże się z promotorem lucyferazy, indukuje ekspresję genów i wytwarza enzymy lucyferazy.
Zastąp pożywkę odczynnikiem testowym zawierającym substrat lucyferazy. Substrat dyfunduje do komórek i reaguje z lucyferazą, wytwarzając bioluminescencję.
Użyj czytnika mikropłytek, aby zmierzyć natężenie światła, które bezpośrednio odzwierciedla aktywność γ-sekretazy, enzymu kluczowego w stanach neuropatologicznych.
Policz komórki NG lub CG za pomocą hemocytometru. Następnie wysiewaj komórki w ilości 20 000
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych