Immunohistochemia do identyfikacji regionu miejsca sinawyego w wycinkach mózgu myszy

Regiony miejsca sinawego, zlokalizowane obustronnie w pniu mózgu myszy, zawierają neurony wytwarzające noradrenalinę i regulują różne regiony w mózgu.

Aby wykryć te obszary miejsca sinawego, zacznij od szklanego szkiełka zawierającego nieruchome, kriokonserwowane sekcje pnia mózgu myszy.

Umyj szkiełko buforem w celu usunięcia śladów utrwalających.

Dodaj bufor zawierający detergent i inkubuj, aby przepuszczalność membran, a następnie umyć.

Wprowadź pierwotne przeciwciała specyficzne dla enzymu β-hydroksylazy dopaminy, który przekształca dopaminę w noradrenalinę, neuroprzekaźnik.

Inkubować, aby umożliwić przeciwciałom interakcję z dopaminą β-hydroksylazą.

Umyć w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał.

Następnie dodaj zielone przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem i inkubuj w ciemności.

Przeciwciała drugorzędowe wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi, a następnie myją.

Dodaj pożywkę montażową do sekcji mózgu, a następnie przykryj i wysusz.

Obserwuj szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Zielona fluorescencja reprezentująca znakowane neurony wytwarzające noradrenalinę w sekcjach mózgu wskazuje na obecność regionów miejsca sinawego.

Pierwszego dnia umyj plastry mózgu na 24-dołkowej płytce 3 razy po 5 minut każdy w PBS. Następnie dodaj 0,5% PBS z detergentem i przepuszczaj je w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Następnego dnia umyj plastry trzy razy po 5 minut za pomocą 0,5% PBSD. Następnie dodać przeciwciało pierwszorzędowe w rozcieńczeniu od 1 do 500 w 0,5% PBSD i inkubować w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 18 godzin.

Trzeciego dnia umyj plastry 3 razy po 10 minut z 0,5% PBSD. Następnie dodać przeciwciało drugorzędowe w rozcieńczeniu od 1 do 1000 w 0,5% PBSD. Owiń płytkę folią aluminiową i inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 16 godzin.

Po inkubacji myć plastry 3 razy po 5 minut z 0,5% PBSD, a następnie przez 5 minut w PBS. Zakryj sekcje za pomocą twardego medium montażowego bez DAPI. Przykryj szklaną pokrywą i susz przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie użyj mikroskopu konfokalnego z ustawieniami do wykrywania sygnału o odpowiedniej długości fali fluorescencji, aby zobrazować wycinki mózgu.