Znakowanie wirusowe i przeszczepianie komórek wyniosłości przyśrodkowej zwoju przyśrodkowego do badań in vivo

Pobranie tkanki wyniosłości przyśrodkowej zwoju, zawierającej progenitorów interneuronów korowych, z genetycznie zmodyfikowanych zarodków myszy.

Dodaj polimer kationowy i zdysocjuj tkankę do zawiesiny jednokomórkowej.

Dodać wektory lentiwirusowe niosące zależny od rekombinazy Cre reporter GFP otoczony miejscami lox. Inkubować.

Polimer neutralizuje ładunki błony komórkowej wirusa i gospodarza, umożliwiając fuzję wirusa i uwalnianie RNA.

RNA wirusa jest transkrybowane wstecznie i integrowane z genomem gospodarza.

Odwirować i wyrzucić supernatant. Wchłonąć nadmiar mediów.

Przenieś komórki na hydrofobową powierzchnię i załaduj je do urządzenia do wstrzykiwania.

Wstrzyknij komórki do znieczulonej kory szczeniaka myszy.

Pozwól szczeniakowi dojść do siebie i rosnąć.

Przeszczepione komórki progenitorowe różnicują się w dojrzałe interneurony w korze.

Podgrupa tych interneuronów ulega koekspresji rekombinazy Cre i RFP.

W tych interneuronach Cre wycina miejsca lox, odwracając gen GFP i umożliwiając jego ekspresję.

Wizualizacja współekspresji RFP i GFP w celu identyfikacji interneuronów wyrażających Cre.

Po przygotowaniu lentiwirusa i rozcięciu MGE zgodnie ze wskazówkami zawartymi w pisemnym protokole, zbierz obie półkule MGE i umieść tkankę w dwóch 1,5-mililitrowych probówkach zbiorczych zawierających 500 mikrolitrów DMEM z 10% FBS.

Próbki należy przechowywać na lodzie do momentu zebrania całej tkanki. Następnie przenieś rurki do okapu z certyfikatem BSL-2. Ostrożnie zassać pożywkę, nie naruszając tkanek MGE osadzonych na dnie probówki.

Następnie dodaj około 500 mikrolitrów wstępnie podgrzanego DMEM z 10% podłożem FBS. Dodać polibren do końcowego stężenia 8 mikrogramów na mililitr i miareczkować za pomocą końcówki pipety P1000, aż do uzyskania zawiesiny jednokomórkowej. Następnie dodaj od 15 do 20 mikrolitrów skoncentrowanego lentiwirusa do każdej probówki.

Następnie dokładnie zamknij każdą probówkę, odwróć do mieszania, a następnie umieść wszystkie probówki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Inkubować komórki z lentiwirusem przez co najmniej 30 minut, ale nie dłużej niż godzinę, ponieważ dłuższy czas spowodował zmniejszenie żywotności komórek. Odwracaj rurki co 10 minut.

Po inkubacji wyjmij probówki z inkubatora i odwiruj w temperaturze 700 razy g w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez trzy minuty, aby osadzać komórki. W kapturze BSL-2 usuń supernatant i wyrzuć do 10% wybielacza. Następnie dodaj 1 mililitr DMEM z 10% FBS i miareczkuj granulki dwa do trzech razy w celu umycia.

Po odwirowaniu jak poprzednio, powtórz ten krok mycia jeszcze dwa do trzech razy, aby usunąć nadmiar wirusa. Po ostatnim umyciu usuń jak najwięcej mediów i połóż każdą tubkę na lodzie.

Ze względu na resztki pożywki po bokach probówki, około 2 do 3 mikrolitrów pożywki pokryje osad komórkowy do czasu rozpoczęcia procedury przeszczepu. Upewniając się, że przez cały czas stosowana jest sterylna technika, wciągnij olej mineralny do 1-mililitrowej strzykawki, a następnie za pomocą igły o rozmiarze 30,5 napełnij całkowicie szklaną pipetę olejem mineralnym.

Następnie przymocuj szklaną pipetę do urządzenia stereotaktycznego i załaduj na tłok. Za pomocą asystenta korzystającego z napędu hydraulicznego przesuń tłok mniej więcej do połowy szklanej pipety, usuwając rozlewający się olej mineralny czystym ręcznikiem papierowym.

Następnie przekręć róg sterylnego ręcznika papierowego w drobny punkt i użyj go do delikatnego usunięcia nadmiaru pożywki nad granulką komórek MGE. Spowoduje to skoncentrowanie gęstości komórek, dzięki czemu można uzyskać mniejsze objętości wstrzyknięć.

Następnie użyj pipety P2, aby powoli wyciągnąć osad komórek i miareczkować jeden do dwóch razy przed dozowaniem na hydrofobową powierzchnię. Objętość powinna wynosić nieco poniżej 1 mikrolitra.

Wsunąć końcówkę igły do zawiesiny kuwety i za pomocą napędu hydraulicznego wciągnąć zawiesinę komórek do pipety. Po znieczuleniu szczeniaka za pomocą hipotermii sprawdź skuteczność znieczulenia, ściskając skórę między palcami za pomocą kleszczy. Nie powinno być widać żadnej reakcji.

Następnie umieść szczeniaka na formie, która znajduje się pod urządzeniem do wstrzykiwania i napnij skórę, odciągając skórę na głowie, a następnie zabezpieczając ją standardową taśmą laboratoryjną. Pracując szybko, manipuluj ramieniem stereotaktycznym, aby ustawić końcówkę szklanej pipety na głowie szczeniaka, prostopadle do powierzchni głowy.

Gdy pipeta styka się z głowicą, należy uznać to za zero. Następnie wepchnij pipetę przez powierzchnię skóry i czaszki do kory mózgowej. Następnie włóż i wsuń pipetę dwa razy przed zatrzymaniem.

W celu celowania w komórki do kory nowej wstrzyknięcia wykonuje się, gdy mikropipeta znajduje się na głębokości 0,1 milimetra. Gdy igła znajdzie się na swoim miejscu, obróć urządzenie hydrauliczne, aby przesunąć tłok do szklanej pipety i wstrzyknąć od 50 do 70 nanolitrów na miejsce.

Powtórz tę procedurę w trzech do sześciu różnych miejscach na różnych poziomach rostralno-ogonowych, jeśli wymagana jest szeroka dystrybucja przekształconych komórek w korze nowej. Po zakończeniu wstrzyknięć należy usunąć szczenię ze sceny i oznaczyć je zgodnie z zatwierdzonymi procedurami.

Gdy szczenię wyzdrowieje i będzie w stanie samodzielnie się poruszać, umieść je z powrotem z karmiącą samicą i resztą miotu. Sprawdź szczenięta po zabiegu i następnego dnia, aby upewnić się, że nie ma oznak pogarszającego się stanu zdrowia.