Badanie migracji limfocytów przez monowarstwę komórek śródbłonka mikronaczyniowego

Weź mikropłytkę z wkładkami transwell pokrytymi białkami ECM, aby promować adhezję komórek.

Dodaj komórki śródbłonka mikronaczyniowego ludzkiego mózgu lub HBMEC do wkładek i pożywki wzrostowej do dolnych przedziałów.

Inkubuj, pozwalając komórkom przylegać i rosnąć w monowarstwę. Komórki te wyrażają ścisłe połączenia, naśladując śródbłonek bariery krew-mózg, który ogranicza przechodzenie komórek i cząsteczek.

Usuń nośnik. Dodać komórki jednojądrzaste krwi obwodowej lub PBMC do insertów i pożywkę hodowlaną do dolnych przedziałów.

Inkubuj, umożliwiając limfocytom PBMC interakcję z komórkami śródbłonka, a następnie przejście między nimi, proces zwany transmigracją.

Opłucz dno wkładki, zbierając przylegające transmigrujące komórki do dolnych komór.

Wprowadź mikrogranulki fluorescencyjne jako odniesienie do oznaczania ilościowego komórek.

Przenieść zawiesinę do probówki, odwirować, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić w koktajlu przeciwciał sprzężonych z fluoroforem w celu znakowania limfocytów.

Transmigrowane limfocyty są gotowe do oznaczania ilościowego za pomocą cytometrii przepływowej.

Aby przygotować wkładki do hodowli komórkowych do testu transmigracji, najpierw dodaj 100 mikrolitrów roztworu fibronektyny do każdej wkładki i do jednego dołka 96-dołkowej płytki o płaskim dnie. Po trzech godzinach w temperaturze 37 stopni Celsjusza zastąp roztwór fibronektyny 100 mikrolitrami HBMEC i dodaj 600 mikrolitrów świeżej pożywki ECM-b do dolnych komór wkładek do hodowli komórkowych.

Następnie umieść płytki z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na trzy do czterech dni. Ponownie zawiesić komórkę jednojądrzastą krwi obwodowej lub próbkę PBMC do stężenia 5 razy 10 do 6 komórek na mililitr w pożywce RPMI uzupełnionej witaminą B27. Następnie odessać pożywkę z dolnych i górnych przedziałów odpowiedniej liczby wkładek do hodowli komórkowych zawierających zlewające się monowarstwy HBMEC i dodać 100 mikrolitrów PBMC na dawcę do wkładek do hodowli komórkowych i do jednego dołka 24-dołkowej płytki na kontrolę in vitro.

Dodać 600 mikrolitrów RPMI plus B27 do dolnych komór wkładek do hodowli komórkowych i 500 mikrolitrów do studzienek kontrolnych in vitro i włożyć płytki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych na sześć godzin. Pod koniec inkubacji za pomocą kleszczy usuń wkładki z kultur komórkowych, ostrożnie spłukując dno 400 mikrolitrami PBS bez dotykania błon

.

Następnie dokładnie wymieszaj 20 mikrolitrów fluorosfer z liczbą przepływów z komórkami w studzienkach doświadczalnych i kontrolnych in vitro i przenieś 1 mililitr powstałych zawiesin PBMC do odpowiednich probówek do cytometrii przepływowej. Zebrać komórki przez odwirowanie i dodać do każdej próbki przeciwciała sprzężone z fluorochromem w 100 mikrolitrach buforu cytometrii przepływowej. Po 30 minutach w temperaturze 4 stopni Celsjusza przemyć komórki 250 mikrolitrami świeżego buforu cytometrii przepływowej i ponownie zawiesić granulki w odpowiedniej objętości buforu cytometrii przepływowej do analizy.