JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 4:10 min • July 8th, 2025
Zacznij od wkładki membranowej zawierającej komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu myszy, przypominające barierę krew-mózg in vitro.
Umieść tę wkładkę w studni przezśródbłonkowego przyrządu do pomiaru oporu elektrycznego lub TEER zawierającej wbudowaną elektrodę.
Dodaj świeże nośniki do dolnej komory.
Umieść pokrywę z elektrodami nad studzienkami TEER, a następnie umieść instrument w inkubatorze i podłącz go do systemu nagrywania.
Elektrody wytwarzają prąd elektryczny w poprzek warstwy komórkowej w celu pomiaru oporu przezśródbłonkowego.
Nienaruszone białka połączeniowe między komórkami utrudniają przepływ prądu, co skutkuje wyższą wartością TEER.
Odłącz przyrząd i wyjmij go.
Zdemontuj pokrywę, usuń trochę pożywki z górnej komory i dodaj wstępnie aktywowane limfocyty T. Ponownie zmontuj przyrząd do pomiaru TEER.
Aktywowane limfocyty T oddziałują z komórkami śródbłonka, uwalniając czynniki zapalne i enzymy cytolityczne, zaburzając integralność połączeń.
To zakłócenie zwiększa przepływ prądu elektrycznego, co skutkuje niższą wartością TEER.
Aby skonfigurować pomiar TEER, umieść 24-dołkowy moduł przyrządu TEER w okapie z przepływem laminarnym. Zdejmij pokrywki i umieść wkładki z MBMEC w przyrządzie za pomocą kleszczy.
Następnie odpipetować 810 mikrolitrów świeżej pożywki do dolnej komory dołków modułu. Dodaj go ostrożnie między wkładką a ścianką modułu. Następnie zamknij pokrywy i umieść instrument w inkubatorze. Podłącz instrument do komputera. Następnie włącz kontroler przyrządu i otwórz oprogramowanie.
W wyskakującym okienku wybierz "Nowy pomiar". Zaznacz pola "Pokaż TEER" i "Pokaż Ccl", a następnie naciśnij "Start". Po zakończeniu pierwszego pomiaru wybierz "Sprawdź wszystkie dołki" w zakładce "wyniki", aby zobaczyć wszystkie wartości TEER i Ccl. Następnie zapisz plik.
Następnie wybierz punkt czasowy do wspólnej hodowli MBMEC z limfocytami T, gdy Ccl jest stabilny i niższy niż 1 mikrofarad na centymetr kwadratowy, a TEER osiągnął maksymalny poziom. Dokładnie sprawdź bezwzględne wartości TEER i Ccl i wyklucz odwierty, w których MBMEC nie rozwinęły wystarczająco zlewających się monowarstw, odznaczając takie studnie.
Pogrupuj pozostałe studnie, klikając je prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję "Dodaj studnię do nowej średniej studni". Nazwij go w wyskakującym okienku i zrób to samo dla wszystkich pojedynczych studni, które mają zostać zgrupowane. Następnie sprawdź wszystkie średnie studzienki, aby potwierdzić, że wszystkie mają te same warunki początkowe przed kokulturą.
W zakładce "Eksperyment" naciśnij "Pauza". Odłącz instrument i wyjmij go z inkubatora. Następnie zdejmij pokrywki z okapu z przepływem laminarnym. Następnie usuń część pożywki z wkładu w górnej komorze studzienki. Dodaj limfocyty T do MBMEC, ostrożnie pipetując 150 mikrolitrów pożywki. Następnie ponownie podłącz przyrząd i naciśnij "Wznów pomiar". Po 24 godzinach naciśnij "Stop" w zakładce "Eksperyment" i zapisz plik.